乳品加工中嗜熱桿菌生物膜特性及其危害

張夢嬌，李 妍，2，*（.北京工商大學，北京市食品添加劑工程技術研究中心，食品質量與安全北京實驗室，北京00048；2.食品安全與營養協同創新中心，東北農業大學，黑龍江哈爾濱50030）

乳品加工中嗜熱桿菌生物膜特性及其危害

張夢嬌1，李 妍1，2，*
（1.北京工商大學，北京市食品添加劑工程技術研究中心，食品質量與安全北京實驗室，北京100048；2.食品安全與營養協同創新中心，東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030）

嗜熱桿菌是乳制品加工中的主要污染菌，影響產品的品質和安全性。在加工生產線上形成生物膜是嗜熱桿菌污染乳制品的主要原因。本文綜述嗜熱桿菌的生物膜形成的特點、危害及其可能的防范措施，為乳制品生產及相關領域的研究工作提供參考。

嗜熱桿菌，生物膜，乳制品

嗜熱桿菌（Thermophilic Bacilli）是包括乳制品在內的許多食品加工中的主要污染菌［1］。它們能夠在較高的溫度（40～70℃）下存活并生長。乳品生產線中的稀奶油分離、殺菌機的預熱段和蒸發濃縮段的操作溫度適宜嗜熱菌生長，它們可附著在生產線中形成生物膜，造成乳制品嚴重污染［2-4］。本文綜述嗜熱桿菌的生物膜形成的特點、危害及其可能的防范措施，為乳制品生產及相關領域的研究工作提供參考。

1 乳品中的嗜熱桿菌

乳制品工業中主要采用55℃培養的方法檢測和分離嗜熱桿菌。此法分離到的嗜熱桿菌包括專性嗜熱菌和兼性嗜熱菌兩類。專性嗜熱菌只能在較高溫度下（40～68℃）生長，主要包括黃熱芽孢桿菌（Anoxybacillus flavithermus）、地芽孢桿菌（Geobacillus spp.）［2］。兼性嗜熱菌主要是芽孢桿菌屬的細菌，其在中溫和高溫下都能生長，包括地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、耐熱芽孢桿菌（Bacillus sporothermodurans）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等［2］。

多數嗜熱桿菌能產生耐熱芽孢，乳制品加工常用的巴氏殺菌不能將其殺死［5］，有些芽孢甚至可以經受超高溫瞬時（UHT）滅菌（140～145℃，2～5 s）而存活［6］。

2 嗜熱桿菌的生物膜

2.1 嗜熱桿菌生物膜的形成

生物膜是微生物細胞與其產生的胞外多糖（EPS）締結，粘附并在無活性或活體表面生長，形成的具有一定結構的微生物聚集體，嗜熱桿菌生物膜的形成與其他細菌相似，通常經過一系列過程：首先菌體細胞通過范德華力、靜電作用力和疏水相互作用力等附著于基質表面，形成初始的可逆粘附［7］。隨后通過產生胞外多糖或其他細胞表面結構與基質形成復合體，從而將細胞固定在表面上，形成不可逆粘附［8］。一旦細胞粘附在表面上，即產生胞外多糖并開始形成微生物群落。這些群落繼續擴大，在EPS基質中形成多層復合的菌體細胞，EPS基質中也會形成水分通道［9］，這種基質可以給菌體細胞提供營養來源。粘附過程和EPS的產生使生物膜內的菌體細胞比懸浮細胞對不良環境的抵抗力更強［10］。

嗜熱桿菌生物膜的形成過程因菌株和環境的不同而不同。乳制品加工領域中的嗜熱桿菌粘附及其生物膜形成機制還不明確，目前研究主要集中于菌體自身性質及不同環境條件對嗜熱桿菌的粘附并形成生物膜的影響。一些基于A.flavithermus和Geobacillus spp.的研究發現營養體和芽孢的粘附可促使嗜熱桿菌生物膜形成，在不銹鋼表面的粘附是其形成生物膜的關鍵［11］。Parkar等研究證實一系列嗜熱桿菌，包括Geobacillus、Anoxybacillus、B.licheniformis、B.coagulans和B.pumilus能夠以相同數量附著在不銹鋼表面和乳垢上，并且芽孢比營養體更容易粘附［12］。

2.2 嗜熱桿菌生物膜的特點

游離的嗜熱桿菌附著于設備表面一段時間后方可適應粘附狀態并開始生長形成生物膜，而菌體從生物膜中釋放的速度并不滯后于其在生物膜中的生長速度，甚至比原代細胞增長更迅速，這與其他細菌的生物膜相似［13］。

有研究認為，細菌形成生物膜的動力及生存優勢主要包括以下幾方面［14］：一是對有害條件的防御：減少湍流和沖刷的影響；保護其免受環境中可能的毒素、抗生素、清潔劑和消毒劑的傷害。二是定植于游離位置：胞外酶的擴散減少，表面上營養物質濃度的增加。三是形成群落并利用群落的潛在優勢：可能通過細菌細胞間的信號轉導來傳遞遺傳信息，包括其抗性基因。

混合菌種的生物膜可能比單一菌種的更穩定［15］，這在適合多菌種生長的加工環境中是很重要的。在混合菌種形成的生物膜中，除細菌細胞外，還有多種真核細胞、胞外多糖（EPS）、酶和其他蛋白質、細菌素、低分子質量的溶質，以及細胞裂解產生的核酸［16］。

2.3 影響生物膜的因素

菌體細胞表面的物理化學特性影響菌體的粘附進而影響生物膜的形成，對于這方面的研究還存在一定的爭議。Faille等發現B.cereus的芽孢在沒有外壁的情況下對不銹鋼的粘附能力有所降低［17］，但Parkar等觀察到除掉A.flavithermus和Geobacillus spp.芽孢的外部蛋白質層時，其對不銹鋼的粘附能力沒有明顯降低［12］。有研究認為芽孢的疏水性越大，粘附性就越強［2］。但Seale等研究來自乳粉的Geobacillus菌株的物理化學特性時卻發現其所研究的菌株芽孢自然情況下大多數呈親水性（pH6.8），且帶負電荷最低、最親水的芽孢在不銹鋼表面的粘附數量最高［18］。Parkar等的研究也得出嗜熱桿菌的芽孢粘附性與疏水性之間并不相關的結論［12］。Palmer等研究發現A.flavithermus的營養體細胞對不銹鋼表面的粘附可能與其細胞的表面蛋白有關，除去一株A.flavithermus菌的表面蛋白則導致其在不銹鋼表面的粘附性降低1個log值［19］。進一步研究發現一株粘附能力比其母系株降低了10倍的A.flavithermus突變株的疏水性低于母系株。Palmer還發現EPS對于嗜熱桿菌的表面粘附影響不大，去除EPS的菌株粘附能力并沒有降低［19］。

環境條件的變化對于嗜熱桿菌芽孢生成和生物膜特性影響較大。55℃和60℃下生長8 h的生物膜中A.flavithermus芽孢所占的比例達到10%～50%，而48℃下生物膜中則檢測不到芽孢的存在［20］。Parkar等采用物理和化學處理的方法分析了A.flavithermus生物膜對環境條件變化的穩定性，發現pH、機械振動和抑菌素等都不同程度影響生物膜的活性和穩定性［21］。

3 對乳制品加工的危害

3.1 造成產品嗜熱菌污染

嗜熱芽孢桿菌能形成抗逆性強的芽孢，具有形成生物膜的能力、較高的生長和繁殖速度、較寬的生長溫度范圍，都使其在加工過程中難以被消除［3］，并且其形成的生物膜作為污染物的存儲庫，使工廠不能徹底清洗［22］，原位清洗能夠清除生產線中游離的營養體和芽孢，但生物膜中的菌體則會留在設備中對下一次生產造成污染［23］。已有研究證實嗜熱桿菌能夠在乳品加工設備表面形成生物膜并能夠在奶垢層中生長，如果生產周期過長，加工設備清洗不當，或者產品在生產線中多次循環處理等，就會造成嗜熱菌的過度生長，因而造成產品的污染問題［2-3］。

3.2 腐敗乳制品酶的來源

生物膜也可能成為一個沒有意識到的導致乳制品腐敗的酶的來源。有研究發現從原料乳貯罐分離到的細菌生物膜可以釋放蛋白酶和脂肪酶［24-26］。嗜熱桿菌能夠產生耐熱的腐敗乳制品酶，在其生物膜生長過程中也有釋放酶造成產品潛在腐敗的可能［27］。

有研究表明，來自污染奶粉生產線的七株嗜熱芽孢桿菌能產生胞外和胞內的蛋白酶和脂肪酶［28］。并且這些酶高度耐熱，足以在乳品生產中經受任何熱處理而在終產品中保持活性，造成產品的腐敗。

3.3 毒素的來源

一些嗜熱芽孢桿菌能產生毒素，例如地衣芽孢桿菌［29］和枯草芽孢桿菌［30］的某些菌株，能產生與蠟樣芽孢桿菌中cereulide類似的毒素，是一種小分子肽類的致嘔吐毒素。有研究發現有些地衣芽孢桿菌菌株與食物中毒事件的原料奶和嬰兒食品有關［31］。對7種嗜熱芽孢桿菌的101株菌進行熱穩定毒素生產的研究發現，巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、堅強芽孢桿菌（B.firmus）、簡單芽孢桿菌（B.simplex）都能產生不同的熱穩定毒素，表現出不同水平的毒性［29］。如果這些芽孢桿菌在乳品生產線中形成生物膜，則在條件適宜的條件下可能釋放毒素污染產品。

4 可能的控制措施

目前乳制品加工中防止嗜熱芽孢桿菌滋生及形成生物膜的手段主要有以下幾方面：

4.1 縮短生產時間，增加清洗頻率

在表面有嗜熱桿菌的不銹鋼表面，嗜熱桿菌的生物膜在6 h即可達到106個/cm2的成熟生物膜水平，而經巴氏殺菌的脫脂乳在適宜溫度下18 h可達到同樣水平［21］，因此縮短生產線連續運行時間，增加清洗，可以防止嗜熱菌形成生物膜。通常牛奶連續處理時長限制在6～8 h，乳粉廠通常將連續生產時長限制在18～24 h［2］。

4.2 原位清洗，協同殺菌

原位清洗（clean in place，CIP）去除牛奶加工線生物膜的能力仍然很有爭議。CIP清洗后的表面即使看上去是清潔的，但微生物仍可能留在表面。有報道從CIP堿洗后的乳品中分離出多種嗜熱芽孢桿菌［32］。微生物群落常常由不同耐藥機制的幾種微生物組成，因此生物膜的消除可以組合使用不同方式進行處理，如CIP清洗與消毒劑，或不同種消毒劑協同使用。協同殺菌處理已有許多報道，其殺菌效果比預測的每種方法總和更強［33］。

4.3 改變加工溫度或減小最適生長溫度區域的表面積

研究發現，改變環境溫度可有效控制嗜熱桿菌的生長和產芽孢，例如將生長環境溫度從55℃降到48℃能防止生物膜中A.flavithermus形成芽孢［20-21］。因此降低或提高加工中適宜嗜熱菌滋生段的加工溫度能抑制嗜熱桿菌的生長及形成生物膜。將奶油分離的溫度從50℃以上降低到45℃以下（約15～30℃）可以延長生產周期并降低嗜熱菌污染。減少最適生長溫度區域的表面積也經常用于控制嗜熱桿菌生長［34-35］。例如采用直接注入蒸汽法（direct steam injection，DSI）替代間接加熱系統可降低殺菌預熱段的換熱接觸面積，蒸汽能迅速增加牛奶的溫度，避免嗜熱菌在最適生長溫度生長。

4.4 雙設備交替使用

在嗜熱菌容易生長的工序使用雙設備系統，例如使用雙預熱系統，其中的牛奶從一個預熱器經過8～12 h生產后奶液直接進入第二個預熱器，此時可對第一個預熱器進行CIP清洗而不影響正常的生產周期。

5 展望

嗜熱桿菌能夠在乳品加工生產線中形成生物膜的特性，嚴重威脅著乳制品的品質。已有研究證實，國產乳粉中嗜熱菌污染嚴重，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、黃 熱 芽 孢 桿 菌（Anoxybacillus flavithermus）和嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）是主要污染菌［36-37］。目前乳制品加工領域嗜熱菌粘附和形成生物膜的機制還不明確，因此對于這方面的研究亟待深入，以便更好地了解嗜熱菌在食品加工中造成產品污染的途徑和方式，從而更有針對性的制定有效的防范措施。

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Biofilm characteristics and harm of Thermophilic Bacillus in dairy products

ZHANG Meng-jiao1，LI Yan1，2，*
（1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；（2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Thermophilic Bacillus was the main contaminating bacteria during the process of dairy products.It affects quality and safety of the product.The formation of biofilm was the main reason for Thermophilic Bacillus to contaminate dairy products.Formation features，hazards and precautionary measures of Thermophilic Bacillus biofilm were reviewed in this paper，providing a future reference for the research of dairy production and its related fields.

Thermophilic Bacilli；biofilm；dairy products

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0388-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.069

2015－07－27

張夢嬌（1992-），女，碩士研究生，研究方向：乳制品加工技術，E-mail：647yang@163.com。

李妍（1977-），女，博士，研究方向：乳制品加工技術，E-mail：yanyan.9999@163.com。

國家自然基金青年科學基金（31401517）；現代農業（奶牛）產業體系建設專項（CARS-37）；北京市屬高等學校創新團隊建設與教師職業發展計劃項目（IDHT20130506）。