高通量測序技術及EST-SSR標記在蔬菜研究上的應用

陳興奎

（遼寧省錦州市農業科學院，遼寧錦州121017）

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高通量測序技術及EST-SSR標記在蔬菜研究上的應用

陳興奎

（遼寧省錦州市農業科學院，遼寧錦州121017）

高通量測序技術又稱下一代測序技術（Nextgeneration sequencingtechnology），1次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，與以往的測序技術相比，其特點是通量高、測序成本顯著降低、測序時間顯著縮短。轉錄組測序（RNA-seq）是利用高通量測序技術直接對由mRNA逆轉錄生成的cDNA序列進行測序，產生數以千萬計的reads數量，從而使得基因組區域中不同基因的轉錄水平可以直接通過比對到該基因組區域的reads數來衡量[1]。在已完成基因組測序的物種中，可將RNA-seq結果與基因組DNA序列數據進行對比，從而得到基因表達、可變剪切、基因結構優化、新基因發現等分析結果。對于沒有參考基因組的物種，可以進行de novo轉錄組測序研究，即對所得到測序讀長片段進行de novo組裝，進而得到該物種的單一基因序列集（unigenes）數據[2]。

迄今，國內外已有多篇關于利用轉錄組高通量測序技術對植物抗病相關基因進行分析研究的報道。李湘龍等[3]對水稻和稻瘟菌互作早期轉錄組進行了測定和分析，克隆和鑒定在互作早期表達的稻瘟菌效應蛋白基因，從總計約12.5M條序列標簽中分離和鑒定了338942條來源于稻瘟菌的序列，并最終定位到779個稻瘟菌預測基因，其中108個基因很可能參與了水稻和稻瘟菌互作過程，42個基因為預測的分泌蛋白基因。通過RT-PCR分析，最終確認了42個預測分泌蛋白基因中有12個基因在侵染水稻早期有顯著的表達，而其中有4個基因表現為侵染早期特異表達。以抗病棉花品種（海島棉品種7124）和黃萎病菌V991菌株為材料，通過RNA-Seq技術研究了在接種病原菌后棉花植株轉錄組的變化，篩選到3442個差異表達基因，揭示了轉錄控制的復雜性，認為木質素和苯丙途徑在植株對黃萎病菌的防御反應中發揮了重要作用。王剛[4]通過So?lexa高通量測序的方法對鹽脅迫處理前后的棉花幼苗進行轉錄組測序，發現了相當多受鹽脅迫處理上調和下調的基因，揭示了棉花幼苗鹽處理前后轉錄組水平復雜的調控網絡。Fernandez等[5]提取了感染咖啡銹菌21d后的咖啡葉片的RNA，并反轉cDNA，用454轉錄組測序平臺（454GS-FLX Titanium）進行了測序，結果獲得了352146條reads，拼接后有22774個contigs，對測序結果分析后發現一些與抗病相關的基因，如PR-5、葡聚糖酶、PR1b、幾丁質酶等。在對菜豆（Phaseolusvulgaris L.）利用454轉錄組測序方法發掘抗病基因序列的研究中發現植物抗病基因大部分都有共同的保守結構域，如NBS、LRR、蛋白激酶（PK）、跨膜結構（TM）和TIR，這些都是R基因的基本結構特征。將轉錄組測序后獲得的169萬條序列和GenBank中的116716條ESTs作為參照序列庫和已知的70多個R基因比對，最后發現了365條非冗余序列有類似的結構，其中有116 （45.48%）條來自于454轉錄組測序、147（40.27%）條來自于菜豆的ESTs、52（14.25%）條是兩者都有的[6]。

基于轉錄組測序技術可以大批量開發SSR （Simple sequence repeats）分子標記。SSR是1類1～6個堿基短片段重復的DNA鏈，是基因或基因組的普通組分。與其它分子標記技術相比，SSR標記具有多態性高、呈共顯性遺傳、重復性好、數量豐富、易操作、對模板DNA質量要求低及遍布整個基因組等優點。因此，在植物遺傳研究的很多方面得以應用[7]。由于基因組SSR沒有基因功能，一般和基因組轉錄區不能緊密連鎖，而EST-SSR是和功能基因緊密連鎖，甚至它本身就是功能基因的一部分[8]。所以EST-SSR在分子育種標記輔助選擇上更為重要。另外EST-SSR來源于物種間保守的表達序列，因此它在相似物種間具有很高的轉移性[9]，非常適合于物種間的比較基因組學的研究。隨著NCBI數據庫中EST序列數目的劇增，越來越多的EST-SSR標記被開發出來，并且被廣泛的應用于遺傳圖譜構建、比較作圖、基因定位、DNA指紋圖譜構建、生物遺傳多樣性以及許多物種的進化研究上。目前在動植物中都開發了大量的EST-SSR標記，并在各類研究中進行利用，如葡萄（V.vinifera）、甘蔗（Sacchar?umspp.）、硬粒小麥（Triticumdurum）、黑麥（Secale ce?reale L）、大麥（Hordeumvulgare L.）、小麥（Triti?cumaestivumL.）、水稻（Oryza sativa L.）、馬鈴薯（So?lanumtuberosumL）、香蕉（Musa nana Lour.）、萵苣（Lactuca sativa L.）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、花生（Arachishypogaca）、蓖麻（Ricinus communis L.）、木薯（Manihot esculenta Crantz）、豌豆（Lathyrus sativus L.）、蘿卜（Raphanus sativus L.）、辣椒（Capsicumspp.）等。

隨著越來越多的重要農作物、栽培品種或模式植物的全基因組被測定，可以預見到不久的將來，科學家們能高效對農作物不同栽培品種進行深入、高效、準確的遺傳差異分析、分子標記分析、連鎖圖譜分析、表觀遺傳學分析、轉錄組分析、全基因組關聯分析等研究，利用分析結果改進農作物的育種技術，加快新品種的育種研究，從而使現代農業生物技術在提高農作與產量、質量、減少農業成本、保護生態環境等方面大顯身手。

參考文獻

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[5] Fernandez D.，Tisserant E.，Talhinhas P.，et al.454py?ro-sequencingof Coffea arabica leaves infected by the rust fun?gus Hemileia vastatrix reveals in planta-expressed pathogen-se?creted proteins and plant functions in a late compatible plantrust interaction[J].Molecular Plant Pathology，2012，13:17～37.

[6] Liu Z.，Crampton M.，Todd A.，et al.Identification of

（上接P64）

的發芽雜草可采用藥劑防除，如灰菜、馬齒莧、薺菜和苣荬菜等；深土層中發芽的雜草如蒼耳、鴨跖草和苘麻等，由于其種子在藥層以下，應選用土表處理除草劑。

玉米田中禾本科雜草和闊葉雜草大部分混生，給農民選擇除草劑類型帶來一定的難度。再加上外部主觀、客觀因素的干擾，大大降低了化學除草劑防除雜草的效果。

4.1客觀因素

4.1.1氣象因素

（1）濕度：土壤表面過干或過濕，施藥后不能形成藥土層。（2）溫度：溫度過高，除草劑揮發、分解量增大，減小了除草劑的實際使用劑量；溫度過低，除草劑活性下降，雜草蠟質層增厚，藥劑無法正常進入雜草體內。（3）風：大風加速了除草劑的揮發和分解，降低了土壤表層濕度。

4.1.2土質因素

土壤有機質含量高，吸附除草劑能力強，降低了除草劑的有效劑量；土壤鹽堿中和與固定部分除草劑，使除草劑劑量相對下降；鹽堿地中的堿草耐藥性較強。

4.2主觀因素

4.2.1除草劑因素

除草劑本身質量問題，如廠家生產工藝不達標，農民買到不合格產品；多元合劑配比不合理，如合劑中乙草胺含量低、2，4-D丁酯含量偏高，除草效果差，常發生藥害。

4.2.2人為因素

（1）除草劑選擇不合理：沒有根據玉米地中雜草群落的數量和種類正確選用除草劑。（2）施藥方法不正確：苗前封閉用水量小，遇高溫大風天中午施藥；苗后用水量大，霧化不好，遇大風天施藥等。（3）施藥時間不對：苗前封閉處理的雜草在出土后施藥，苗后莖葉處理的雜草在4葉以后施藥或遇雨施藥等。（4）用藥量不適宜：雜草密度大、惡性雜草多的地塊及鹽堿地沒有適當增加用藥量，低溫干旱情況下沒有適當加量等。

玉米田化學除草應本著安全、節約、高效的原則選擇合適劑型、施藥適期、安全有效劑量和正確的施藥方法，以確保化學除草防效和對玉米生產的安全。

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