人類未成熟卵母細胞的體外成熟培養研究進展

胡燎燎，張 靜，鄭月慧

(南昌大學a.醫學實驗教學中心； b.第一附屬醫院生殖中心；c.基礎醫學院生理學教研室，南昌 330006)

人類未成熟卵母細胞的體外成熟培養研究進展

胡燎燎a，張 靜b，鄭月慧c

(南昌大學a.醫學實驗教學中心； b.第一附屬醫院生殖中心；c.基礎醫學院生理學教研室，南昌 330006)

隨著人類生育年齡的推遲及二胎政策的全面放開，不孕癥、卵巢早衰、卵巢儲備功能不足等女性生殖疾病罹患率也呈逐年上升趨勢。人類未成熟卵母細胞的體外成熟(in vitro maturation，IVM)培養一直是國內外生殖醫學領域研究者關注的熱點。體外培養卵泡生長狀態受獲取卵泡途徑、培養環境、培養方案等多種因素影響。文章就人類未成熟卵母細胞IVM培養的臨床適應證、培養方案及影響因素作一綜述，為相關研究人員和臨床工作者提供參考。

未成熟卵母細胞； 體外成熟培養； 培養方案； 影響因素； 人類

隨著二胎政策的全面放開，女性的生育需求日益強烈，但多囊卵巢綜合征、卵泡發育遲緩、卵巢儲備功能不足等卵子成熟障礙所致不孕癥的發生率也呈快速上升趨勢。據世界衛生組織統計，全世界不孕癥患者已達1億左右，中國的不孕率已由20年前的3%提高至12%左右[1]。隨著社會經濟的發展，越來越多的不孕不育患者選擇人類輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)繁衍后代。傳統的ART是指人工授精(artificial insemination，AI)和體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)，而人類未成熟卵母細胞的體外成熟(in vitro maturation，IVM)培養是一項新的ART衍生技術。由于IVM技術可避免傳統的IVF引起的卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)[2]，并可減少治療費用，因此近30年來受到廣泛關注[3-4]。1991年，Cha等[5]首次對不孕癥患者應用IVM技術，并誕下1名健康嬰兒。目前，世界范圍內約有5000名IVM試管嬰兒誕生[6]，而國內掌握IVM技術的醫院和機構較少。筆者就人類未成熟卵母細胞的IVM培養研究進展作一綜述。

1 IVM的優點與臨床適應證

IVF方案要求患者接受一段時間的促性腺激素(gonadotropins，Gn)治療以促進排卵。部分接受治療的女性，尤其是多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)患者，由于過度刺激卵巢，而易導致OHSS。IVM在體外進行，無需或僅需少量激素作用，具有減少治療費用、避免藥物不良反應、簡化醫療監控過程的優點。由于技術不成熟等原因，IVM卵母細胞成熟率及發育潛能較自然狀態下的體內卵母細胞低，受孕率較IVF卵母細胞低。目前，IVM主要的臨床適應證有：1)伴有PCOS的不孕癥。2)有生育要求的癌癥患者，如小竇狀卵泡在體外培養46～48 h即可發育成熟，因此即將進行放、化療而需短期內采取生殖力保存措施的患者可選擇IVM替代IVF。2014年，Prasath等[7]首次報道卵巢癌患者行卵巢切除術后，采用IVM卵母細胞發育、受精而來的胚胎進行冷凍保存，最終成功產下嬰兒。3)LH受體缺陷的患者也可采用IVM體外獲取成熟卵母細胞[8]。

2 IVM實施方案

根據Gn使用情況，將IVM實施方案大致分為以下幾種：1)經典IVM方式：最早的IVM技術方案中不加入任何Gn。當卵泡直徑達到10～12 mm而未形成優勢卵泡時結束培養。該方案不僅適用于PCOS患者，還適用于排卵正常的個體。2)添加卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)培養。FSH對卵泡發育和卵母細胞成熟十分重要，FSH水平不足或缺乏會影響排卵。在培養時加入小劑量FSH可增加獲卵數、體外培養成熟率以及妊娠率[9-10]。一般在體外培養的第3天加入100～150 U 的FSH，連續3d至卵泡達到10～12 mm[11]。人絕經期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG)含FSH和LH，可促進IVM卵母細胞生長，增加獲卵數和妊娠率[12-13]。3)添加人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)培養。在培養時，加入hCG(一般為10 000 U)有助于卵母細胞減數分裂的恢復[14]，并能夠增加妊娠率。有研究[15-16]顯示，當PCOS患者行IVM時，hCG可以顯著提高卵母細胞成熟率、受精率、妊娠率和出生率。4)聯合使用FSH和hCG。當體外培養卵母細胞時，聯合使用FSH和hCG可進一步提高獲卵數、卵母細胞成熟率、種植率和臨床妊娠率[17]。

3 影響因素

與自然狀態下和傳統的IVF等輔助生殖技術中卵母細胞成熟方式不同，IVM未成熟卵母細胞的減數分裂在體外完成，該過程受多種因素影響。

3.1 取卵方式與時間

用于IVM的未成熟卵泡可直接從陰道采集，也可從手術切除的體外卵巢組織上采集[18-19]。用于IVM的卵母細胞恢復能力受陰道采集時的抽吸壓力和針頭型號的影響。較高吸取壓力和較粗針頭有利于卵母細胞恢復，但會損傷卵母細胞外的卵丘細胞。與IVF獲取卵母細胞不同，陰道獲取卵母細胞用于IVM時，需縮短采集針的長度，增加針的硬度，并減小吸取時的壓力(大約為56 mmHg)[4]。有文獻[20]報道，將卵母細胞采集針反復在卵巢基質上抽吸的過程中逐漸增加抽吸壓力，可采集到更多卵泡。卵泡越小，卵母細胞恢復減數分裂進而發育成熟的能力越弱，但體積較大的優勢卵泡可分泌大量雌激素而引起周圍卵泡閉鎖。因此，過早或過晚結束培養都會對卵母細胞的質量產生不利影響。目前，一般在卵泡直徑達到10～12 mm時結束培養。有研究[21]表明，如果在結束培養前35～38 h加入hCG，在結束培養時的卵母細胞的直徑大小將對培養結果無明顯影響。

3.2 體外培養方法

在體外培養時的卵泡所處空間結構的不同，卵泡體外培養方法被大致分為微滴(一維)培養、二維培養和三維培養。將卵泡直接放在培養皿中進行一維法培養時，不利于卵母細胞與其周圍顆粒細胞之間的相互作用，且卵泡因重力作用而失去三維結構，進而影響卵母細胞生長[22]。目前，常采用二維培養法和三維培養法對卵泡進行培養。利用顆粒細胞或STO細胞在培養皿底部鋪飼養層可構建二維培養環境，而在海藻酸鈉水凝膠等特殊材料包裹后，包埋培養可構造三維立體結構的卵泡培養環境[23]。另外，卵泡生長受到組織密度的調節，低密度條件下卵泡可加速生長[24]。Xiao等[25]采用“兩步法”，通過IVM培養而成功獲取成熟卵母細胞，即在三維培養環境中培養竇前卵泡至竇狀卵泡階段，隨后去除部分卵泡，使細胞密度降低，從而促進卵母細胞生長，并最終獲取成熟卵母細胞。

3.3 培養液添加成分

將未成熟的小竇狀卵泡從人體內取出后，卵母細胞所處環境即發生變化，與其直接接觸的培養液成分將對卵母細胞的發育、成熟、受精能力等產生重要的影響。適當添加Gn有助于獲取高質量的IVM的卵母細胞，添加促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRHa)，可促進人IVM的卵母細胞的成熟和排卵，并最終產下嬰兒[26]。在培養液中加入表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)可增加人IVM的成功率[27]。減數分裂抑制劑可延遲IVM的卵母細胞減數分裂的恢復，而cAMP可促進減數分裂的發生。在培養液中加入不同濃度和種類的cAMP調節因子，可使cAMP濃度增高，有利于IVM的卵母細胞的發育[28-29]。另外，IVM的卵母細胞的細胞質與細胞核并非同步成熟。生發泡破裂排出第一極體標志著卵母細胞核的成熟，但較難對卵母細胞質成熟程度進行檢測。有文獻[30]報道，當生殖力保存時，在對卵巢組織或卵泡進行玻璃化處理的過程中玻璃化液有利于IVM和后期的胚胎發育，可能與卵母細胞質、核非同步成熟有關。

4 展望

近年來，由于生育問題形勢嚴峻，而IVM技術快速發展，其應用越來越廣泛。相對于IVF和自然妊娠而言，盡管IVM存在妊娠率和出生率低的問題，但其具有安全、操作相對簡單快捷的特點，使其逐漸成為IVF的替代療法。在IVF和體外胚胎培養等傳統ART技術的使用過程中存在導致基因組印跡異常的風險[31]，而該現象在IVM中尚未發現，并在一定程度上進一步證實了IVM的安全性和未來更廣泛的接受度[32-33]。卵母細胞成熟受染色質結構、線粒體分布等因素的影響[12]。卵母細胞與卵丘細胞之間的相互作用和信號交流可調控卵母細胞減數分裂抑制與恢復[34]，是IVM的另一關鍵影響因素。為進一步提高IVM技術水平，未來應從分子水平和亞細胞結構水平全面了解在卵母細胞成熟過程中的調控因素，通過相關技術檢測，有針對性地優化未成熟卵母細胞的IVM培養方案。

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(責任編輯：胡煒華)

Research Progress of In Vitro Maturation of Human Immature Oocytes

HU Liao-liaoa，ZHANG Jingb，ZHENG Yue-huic

(a.MedicalExperimentalTeachingCenter； b.ReproductiveCenteroftheFirstAffiliatedHospital； c.DepartmentofPhysiologyofBasicMedicalSchool，NanchangUniversity，Nanchang330006，China)

With the delay of childbearing age and the full implementation of Two-Childen Policy,the prevalence of reproductive diseases including infertility,premature ovarian failure and diminished ovarian reserve increases year by year.In vitro maturation(IVM) of human immature oocytes is a hot spot in the field of reproductive medicine.The growth of follicles cultured in vitro is affected by multiple factors such as approaches to oocyte retrieval,culture environment and culture regimens.This paper reviews the clinical indications,culture methods and influencing factors of IVM of human immature oocytes to provide more information for relevant researchers and clinical workers.

immature oocytes; in vitro maturation; culture methods; influencing factors; human

2016-11-09

國家自然科學基金(81360100)；江西省衛生廳科技計劃項目(20113023)

胡燎燎(1990—)，女，碩士，主要從事生殖醫學的研究。

張靜，主治醫師，E-mail：65304902@qq.com。

R711.6； R339.2

A

1009-8194(2016)12-0095-04

10.13764/j.cnki.lcsy.2016.12.039