加味天雄散對(duì)少弱精子癥模型大鼠附睪氧化損傷的保護(hù)作用*

耿 強(qiáng)，歐陽(yáng)斌，郭 軍，王 福，韓 強(qiáng)，趙 玉，李 重，余國(guó)今，高慶和，張繼偉，曾 銀

(1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科，天津 300000;2．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科，北京 100091; 3．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院男科，北京 100010)

加味天雄散對(duì)少弱精子癥模型大鼠附睪氧化損傷的保護(hù)作用*

耿 強(qiáng)1，歐陽(yáng)斌1，郭 軍2△，王 福2，韓 強(qiáng)3，趙 玉1，李 重1，余國(guó)今2，高慶和1，張繼偉2，曾 銀2

(1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科，天津 300000;2．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科，北京 100091; 3．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院男科，北京 100010)

目的:觀察加味天雄散對(duì)少弱精子癥模型大鼠附睪內(nèi)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響并研究其作用機(jī)制。方法:將腺嘌呤按80mg/ml濃度配制，并對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃2周，造模成功后按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型組、中藥組、正常對(duì)照組，中藥組連續(xù)給藥加味天雄散湯劑4周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)各組大鼠附睪精子密度和活率，取經(jīng)固定的睪丸組織石蠟包埋切片，檢測(cè)附睪組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。結(jié)果:與模型組比較，加味天雄散能顯著改善大鼠睪丸組織病理狀態(tài)，顯著提高生精障礙大鼠模型的精子密度和精子活率，同時(shí)提高生精障礙大鼠附睪內(nèi)SOD活性，降低附睪組織中MDA水平。結(jié)論:加味天雄散能夠提高附睪組織中的抗氧化水平，對(duì)腺嘌呤導(dǎo)致的大鼠生精功能障礙具有保護(hù)作用。

加味天雄散;少弱精子癥;附睪氧化;大鼠;男性生育能力

男性不育癥是影響男女雙方和家庭的全球性問(wèn)題。我國(guó)相關(guān)流行病學(xué)資料顯示，近10年來(lái)我國(guó)男性精液質(zhì)量呈下降趨勢(shì)［1］，少弱精子癥已成為影響男性生育能力的最常見(jiàn)原因［2］，其中約19%的男性不育與精子活動(dòng)力低下相關(guān)。少弱精子癥的病理機(jī)制目前尚不十分清楚，因此臨床大多治療方法仍屬于經(jīng)驗(yàn)型治療［3］。活性氧(ROS)為近年來(lái)少弱精子癥研究的熱點(diǎn)，相關(guān)研究證實(shí)，ROS產(chǎn)生過(guò)多是造成男性不育癥的重要病因之一［4］。我們?cè)谙惹把芯恐邪l(fā)現(xiàn)，加味天雄散具有良好的臨床療效。前期的實(shí)驗(yàn)研究也證明，其具有較強(qiáng)的清除氧自由基作用。基于以上研究我們擬通過(guò)觀察加味天雄散對(duì)少弱精子模型大鼠附睪SOD、MDA含量的影響，探討其提高精子活力的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量250～300 g，常規(guī)飼養(yǎng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物自由攝食飲水，室溫控制在20～25℃、相對(duì)濕度40%～60%的環(huán)境下飼養(yǎng)。

1．2 主要設(shè)備

SOD采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)，MDA采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其他設(shè)備有中興202型電熱恒溫干燥箱(北京中興儀器有限公司)、KUBOTA3740型高速離心機(jī)(日本生產(chǎn))、DK-600A型電熱恒溫水箱(深圳銘科化工有限公司)，精液常規(guī)分析檢查采用精液全自動(dòng)分析系統(tǒng)(北京中科恒業(yè)科技有限公司生產(chǎn))進(jìn)行精液參數(shù)分析。

1．3 動(dòng)物分組及造模

清潔級(jí)Wistar雄性大鼠75只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、中藥全方組、中藥補(bǔ)腎組、中藥健脾組5組各15只。組內(nèi)動(dòng)物分別標(biāo)記編號(hào)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。根據(jù)賈金銘等實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，采用腺嘌呤最佳濃度100 mg/ml、1 ml/(100 g·d)劑量灌胃，空白組灌胃等量生理鹽水，造模結(jié)束停止灌胃腺嘌呤。

1．4 給藥方法

第11天起，中藥全方組、中藥補(bǔ)腎組、中藥健脾組給予中藥灌服。加味天雄散組成:附子6 g，白術(shù)15 g，桂枝10 g，龍骨10 g，茯苓15 g，黃芪10 g，菟絲子15 g，制首烏15 g，枸杞子20 g，刺五加10 g，肉蓯蓉10 g，丹參10 g。補(bǔ)腎組全方中去掉白術(shù)、茯苓、黃芪;健脾組全方中去掉菟絲子、制首烏、枸杞子、肉蓯蓉，采用單味中藥配方顆粒(免煎中藥由江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn))加熱水(水溫為80～100℃)約300 ml充分?jǐn)嚢琛８鶕?jù)人與動(dòng)物體表面積換算濃縮為1 ml藥液/100 g體質(zhì)量的濃縮液后，給予全方組動(dòng)物灌胃，每日2次，空白組和模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃30 d。

1．5 取材

上述2批動(dòng)物分別于第11天及第30天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死，取血(大約5 ml)制備血清，迅速解剖摘取睪丸、附睪、前列腺，觀察外觀形態(tài)并稱(chēng)重。

1．6 檢測(cè)指標(biāo)

單側(cè)睪丸分組放入10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)包埋、切片、HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;附睪精子密度及活力:將大鼠的附睪頭部和尾部各沿縱向垂直剪2次后，用孵育緩沖液2 ml孵育10 min，滴入精子計(jì)數(shù)池，采用計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量分析檢測(cè)精子密度、精子活率和附睪MDA、SOD水平。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 加味天雄散對(duì)模型大鼠睪丸組織的病理學(xué)影響

正常組大鼠睪丸生精上皮、各級(jí)生精細(xì)胞排列規(guī)則，血管豐富，間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育良好，生精小管腔均可見(jiàn)大量精子(圖1);模型組大鼠睪丸生精上皮明顯減少，生精細(xì)胞排列紊亂，部分層面缺失，生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，生精小管腔內(nèi)空虛，成熟的精子明顯減少，間質(zhì)細(xì)胞減少或消失(圖2);全方治療組鏡下表現(xiàn)與正常組基本相同，生精小管管壁較厚，生精細(xì)胞規(guī)則，基底面可見(jiàn)各個(gè)發(fā)育階段的細(xì)胞，細(xì)胞增殖旺盛，腔內(nèi)可見(jiàn)成熟精子且間質(zhì)稀少，血管豐富(圖3)。

圖1 正常組大鼠睪丸病理

2．2 加味天雄散及其拆方對(duì)模型大鼠附睪SOD和MDA含量的影響

表1顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠附睪SOD活力明顯降低;與模型組比較，補(bǔ)腎組和全方組大鼠附睪SOD活力明顯提高;與補(bǔ)腎組大鼠比較，全方組大鼠附睪SOD活力提高更為明顯。與正常組大鼠比較，模型組大鼠附睪MDA含量明顯升高;與模型組比較，補(bǔ)腎組和全方組大鼠附睪MDA含量明顯降低;與補(bǔ)腎組大鼠比較，全方組大鼠附睪MDA含量降低更為明顯。

圖2 模型組大鼠睪丸病理

圖3 全方治療組大鼠睪丸病理

表1 加味天雄散及其拆方對(duì)模型大鼠附睪MDA、SOD含量影響

2．3 對(duì)大鼠附睪精子濃度及活力的影響

表2顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠精子數(shù)量減少、活力明顯降低;與模型組比較，補(bǔ)腎組和全方組大鼠精子數(shù)量和精子活力明顯提高;與補(bǔ)腎組大鼠比較，全方組大鼠附睪精子數(shù)量和精子活力提高更為明顯。

表2 加味天雄散及其拆方對(duì)模型大鼠附睪精子質(zhì)量影響(±s)

表2 加味天雄散及其拆方對(duì)模型大鼠附睪精子質(zhì)量影響(±s)

注:與正常組比較:*P＜0．05;與模型組比較:#P＜0．05，##P＜0．01;與補(bǔ)腎組、健脾組比較:△P＜0．05

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3 討論

少弱精子癥的可知病因眾多，包括生殖道感染、精液液化異常、精索靜脈曲張、免疫因素、內(nèi)分泌因素、遺傳性因素、吸煙、飲酒及藥物因素等，但這些因素如何引起精子活力的確切機(jī)制不明，而且還有約30%～40%的患者尚未發(fā)現(xiàn)明確的病因［5］，可見(jiàn)弱精子癥的病理機(jī)制目前尚不十分清楚，因此現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在臨床治療中缺乏針對(duì)性，許多治療方法均為經(jīng)驗(yàn)性且療效未達(dá)預(yù)期。活性氧(ROS)是機(jī)體組織正常有氧代謝的產(chǎn)物，主要包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥自由基等。在生理情況下，ROS的產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡，如果ROS的產(chǎn)生速度(氧化速度)超過(guò)了機(jī)體對(duì)其清除的能力(抗氧化能力)，可使機(jī)體內(nèi)ROS堆積，致使機(jī)體處于一種應(yīng)激狀態(tài)，即氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而造成機(jī)體損傷;線(xiàn)粒體是ROS作用的重要靶相細(xì)胞器，由于精子細(xì)胞富含線(xiàn)粒體，因此精子活性氧的產(chǎn)生在其線(xiàn)粒體內(nèi)相當(dāng)活躍，同時(shí)精漿中存在著大量抗氧化酶以便保持活性氧的產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，精漿中的SOD是活性氧的重要清除物質(zhì)，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡。若平衡被破壞則將使精漿中的活性氧增多，精子功能受到影響［6］。人體內(nèi)存在酶或非酶的自由基清除系統(tǒng)，SOD等是抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，在清除自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物方面發(fā)揮著重要作用［7］。MDA是細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物中具有代表性的產(chǎn)物，是細(xì)胞膜損傷的標(biāo)志物，可間接反映機(jī)體細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度和體內(nèi)的氧自由基代謝狀況。

中醫(yī)學(xué)對(duì)男性不育癥的認(rèn)識(shí)已有數(shù)千年的歷史，屬于“無(wú)子”“男子艱嗣”等范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載“腎藏精”理論，提出了以腎為軸心、以先天之精為中心的生殖學(xué)說(shuō)，因此腎所藏之精的虧虛是造成不育癥的根本原因，也是采用補(bǔ)腎益精為主治療男性不育癥的依據(jù)［8］。大樣本流行病學(xué)調(diào)查顯示，2054例男性不育癥中醫(yī)辨證分型屬腎虛者1261例，占總病例61．4%，也反映出腎虛是男性不育癥的主要病機(jī)［9］。男子不育癥的病位雖在腎，但也與脾、肝、心等其他臟腑有關(guān)，尤重在腎與脾。因脾為后天之本，氣血生化之源，所以若要腎精足先要脾胃健，只有脾胃健運(yùn)、臟腑之精充盛、腎精充盈，才能“精氣溢瀉”而繁衍后代［10］。

在男性不育癥的治療中，采用脾腎同治的原則是中醫(yī)脾腎相關(guān)理論良好的體現(xiàn)。天雄散出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治第六》且有方無(wú)論。我們?cè)谔煨凵⒌幕A(chǔ)上加入茯苓、黃芪健脾助運(yùn)，益后天化生之源以供養(yǎng)先天;加入菟絲子、制首烏、肉蓯蓉、枸杞子等以補(bǔ)腎填精［11］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也支持我們的觀點(diǎn)。彭宇靜等發(fā)現(xiàn)，菟絲子水煎液可明顯提高人精子體外活動(dòng)功能［12］，肉蓯蓉能促進(jìn)睪丸生精功能，改善附睪微環(huán)境，提高附睪組織抗氧化能力［13］;枸杞子能滋補(bǔ)肝腎，其成分枸杞多糖可以顯著提高缺氧小鼠血漿中總SOD活性［14］;黃芪中的黃芪總黃酮具有很好的抗氧化作用［15］。我們?cè)谂R床實(shí)踐中也取得了較好的療效，因此在前期臨床研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了相關(guān)動(dòng)物研究。本研究發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤灌胃后大鼠睪丸生精上皮明顯減少，生精細(xì)胞排列紊亂，數(shù)量顯著下降，生精小管管腔內(nèi)空虛，附睪SOD活力明顯降低，附睪MDA含量明顯升高，表明少弱精子癥模型成功。在相關(guān)中藥復(fù)方的干預(yù)下，我們發(fā)現(xiàn)加味天雄散能有效改善大鼠生精功能，提高生精障礙大鼠模型的精子密度活率，同時(shí)增強(qiáng)生精障礙大鼠附睪內(nèi)SOD的活性，降低附睪組織中MDA水平，可見(jiàn)加味天雄散能夠通過(guò)提高附睪組織中的抗氧化水平，對(duì)腺嘌呤導(dǎo)致的大鼠生精功能障礙起到修復(fù)作用。

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R285．5

B

1006-3250(2015) 11-0122-03

2015-02-13

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81202695);中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院優(yōu)勢(shì)病種(CACMS08Y0025);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(ZZ070855)

耿 強(qiáng)，河北承德人，主治醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合男科疾病的臨床與研究。

△通訊作者:郭 軍，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，Tel:010-62835134，E-mail:guojun1126@126．com。