HLA-B27在檢測強直性脊柱炎方法上的研究進展

中國人民解放軍第211醫院（150080）張怡 王富禹

強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)又稱變形性脊柱炎、類風濕性脊椎炎，它是一種自身免疫性疾病。發病部位主要包括骶髂關節、脊柱骨突和脊柱旁軟組織，這當中以骶髂關節病變最多見，常可致畸，且該病具有遺傳性，但現如今發病機理尚不確切。強脊炎多累及青壯年，據報道在國內的患病率為0.26%[1]。正因為其病因復雜，早期沒有典型的影像學改變，發病不明顯，又常見腰背腿痛，在臨床上往往與其他的腰腿痛相模糊。增加了臨床上誤診和漏診的幾率，這就使得AS患者從發現癥狀到確診疾病通常在5～6年以上[2][3]。AS患者的平均年齡為29.4歲及性別多為男性，異于HLA-B27陽性的非AS患者、HLA-B27陰性的非AS患者，對健康體檢者資料統計結果進行分析，揭示了該病具有很明顯的特異性[4]。該病的另一特點：早期進展慢，后期進展快，可以在很短時間內形成駝背畸形，關節強直。由此可見，早期的臨床診斷就顯得格外重要了。正因為HLA-B27抗原在AS發病過程中扮演了重要的角色，加之較強的相關性，使得HLA-B27的檢測可為AS的診斷和鑒別提供堅定的依據[5][6]。

1 HLA-B27基因學特性

HLA（Human Leukocyte Antigen，人類白細胞抗原又稱移植抗原）是人類主要組織相容性復合體的表達產物，是一種多態系統，在機體當中可識別細胞和誘導免疫反應。HLA-B27同一亞型在不同人群中與AS的關聯程度也各有不同，2702、2704、2705亞型與AS的發生呈正相關，而2703、2707、2708、2709與AS的發生呈負相關[7]。其次研究還發現，B27基因多態性存在地域性差異，尤其是在AS患者中的分布和誘發AS的發病風險方面尤為突出，可見地區不同的人群中，患者在遺傳學和發病機制上是不同的[8]。不僅如此，HLA-B27抗原的表達也與其他種類的疾病相關。由此可見，臨床的診斷離不開HLA-B27檢測的準確性。

2 HLA-B27的檢測方法

CT具有較高的分辨率，能夠對AS骶髂關節病變進行較準確的分級，是診斷AS骶髂關節病變的主要檢查方法；而MRI能夠顯示脂肪沉積、關節軟骨異常及骨髓水腫等改變，可作為AS骶髂關節病變的早期診斷方法[9]。骶髂關節CT與HLA-B27檢測結果高度契合，無顯著性差異，有助于早期診斷。骶髂關節CT檢測結果可為強脊炎各個時期臨床分期的重要依據來源[10]。

目前臨床上檢測H L A-B 2 7基因的方法隨著科學技術的發展而不斷進步，一類是抗原水平的血清學檢測法，包括經典的微量淋巴細胞毒試驗（Microlymphocytotoxicity text，MLCT）又稱補體依賴細胞毒實驗、流式細胞分析法；另一類則是基因水平的DNA分型技術，如聚合酶鏈反應PCR-SSP法、實時熒光PCR技術。目前對于HLA-B27的研究已經深入到等位基因水平。

2.1 微量淋巴細胞毒法 微量淋巴細胞毒法(MLCT)，原理是淋巴細胞與血清中特異性抗體結合，加入補體可使細胞溶解、死亡。因為細胞膜具有不同的通透性，染料只能使得死細胞著色，接下來根據死細胞占的百分比，判斷是否存在HLA-B27抗原及其與抗體的反應強度。田衛花等人的實驗結果表明MLCT法敏感度達0.801[11]。但目前認為，MLCT方法可能會因感染等因素影響B27分子的數量或影響其分子結構而造成假陰性。除此之外，還要求淋巴細胞的活力要高，過度破碎的細胞容易造成假陽性。因此，雖說MLCT方法操作簡便，但不足之處為最少需要新鮮血液3mL且一定要有足夠多的活淋巴細胞，純度的高低、單抗效價、補體差異的不同情況都會影響結果，靈敏度較差、操作費時，以上都會造成漏檢或假陽性等不被希望出現的結果[12]。

2.2 流式細胞術法 流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是一種新型的分選技術和分型技術，能快速地測量細胞或亞細胞結構。再結合單克隆抗體，迅速區分出淋巴細胞亞群，以此檢測HLA-B27抗原陽性的細胞百分比，判斷其是否為陽性則依據檢測出的標定陽性值。臨床上的優點是操作簡便、快速，但是仍存在儀器昂貴，對操作人員及待測樣本的質量要求較高等問題，并且由于熒光易淬滅，限制了這項技術的推廣，所以當前其只能在規模較大的醫院應用。此外，HLA-B27與其他的HL A-B族抗原之間差異較小，免疫學檢測存在較高的交叉反應，假陽性率較高，影響檢測結果的準確性[13]。流式細胞儀檢測法特異性不高，與所用的單克隆抗體有關，對檢測結果造成假陽性的影響，而使特異性下降[14]。

2.3 PCR-SSP PCR-SSP（sequence specific primer）即序列特異引物引導的PCR反應。設計出一整套等位基因組特異性引物，擴增該特異性引物，將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，出現目的條帶即為陽性。隨著基因領域在臨床檢驗中的應用越來越廣泛，以PCR為基礎，已經逐漸演變出PCR-SSP，實時熒光定量PCR等多種基因檢測方法，具有較高的靈敏度和特異性。可以很好的避免血清學方法的大多數缺點和不足，并且可以進一步區分HLA-B27的多種亞型，是HLA-B27檢測的發展方向[15]。黃寶英等人研究發現用PCR檢測B27基因比流式細胞儀檢測的準確性更高[16]。艾金偉等人經統計發現FCM法和PCR-SSP檢測HLA-B27對AS的診斷準確性相當[17]。于莉的研究表明，PCR-SSP法、FCM法及MLCT法三種方法檢測血清HLA-B27對診斷AS的特異度均較高，且差異無統計學意義（P＞0.05）[18]。因此，在臨床上還需要大量的檢測樣本數據來進一步對診斷準確性的研究進行驗證。

2.4 實時熒光PCR技術 實時熒光PCR技術就是指將熒光基團加入PCR反應體系，根據熒光信號積累情況的不同來監測整個PCR進程，最后未知模板通過與標準曲線的對比來定量分析。用實時熒光定量法對流式細胞術檢測HLA-B27抗原為臨界值邊緣樣本具有重要價值，該法的臨床適用性比FCM更具優勢。熒光定量PCR法是近年來發展較快的一種檢測手段，具有傳統的PCR所不可比擬的優點，該項技術對強直性脊柱炎的早期和輔助診斷具有重要的臨床意義[19]。戎奇吉等人研究利用兩種比較成熟的熒光定量法：SYBR染料法和Taqman特異探針法，構建了相關的HLA-B27檢測體系，并對這兩種檢測體系的參數特征進行了試驗比較，從試驗數據結果可以看到，在檢測范圍上，兩個體系均具有較寬的線性范圍；靈敏度高，SYBR體系可以達到102copies/tube[20]。

馬志超等人采用的實時熒光PCR（熒光染料法），使用的染料是一種新型染SuperGreen，相比之前所講的SYBRGreen，大大提高了信號強度。在結果的判定上，實時熒光PCR技術更加直觀，可以實現直接從曲線圖來判斷是否陽性。之前用過的PCR-SSP法，三年的平均陽性率為33.3%，而該研究所采用的方法陽性率為45%，進一步揭示熒光PCR法的特異性和靈敏度比PCR-SSP法更高[19]。該技術與流式細胞術兩者均能夠準確、可靠地檢測人類白細胞抗原―B27，但相對于流式細胞術而言，前者的優點是能夠識別出雙陽性結果[21]。

相比之前的檢測方法，高的靈敏度，簡單的操作，相對低廉的試劑等成為實時熒光PCR技術的一大特點，更適合于檢測大樣本，有利于各個實驗室之間數據的橫向比較。具有極好的臨床應用價值和前景。

3 HLA-B27檢測結果對于強直性脊柱炎診斷的意義

骶髂關節是強脊炎最初敏感的部位，放射性檢查是診斷的關鍵，但恰恰有些患者患有背痛，但無經典的放射學特征，使得醫生無法確診，延誤治療時間；還有些患者因為腰痛、晨僵而到醫院看病，經腰椎CT檢查診斷為“腰椎間盤突出癥”，便習以為常地認為CT診斷已經明了，可以確診，誰曾想，原來部分強直性脊柱炎的病人可并發腰椎間盤突出癥，壓迫神經引起疼痛，因此錯失最佳治療機會。如果不能做到及時地控制病情，那么往往造成很嚴重的后果。不僅失去日常的工作能力，同時還會對家庭造成很大的影響與負擔。早期診斷尤為重要，可以減少疾病的發展機會，降低致殘率，提高愈后質量。早期發現、早期診斷、早期治療可以有效地降低致殘率。在國外AS的診斷上根據患者身體疼痛的情況和HLA-B27陽性等特點，為風濕病專科醫師提供診斷依據[22]。

對于一個漫長，復雜，隱匿的疾病來說，想要對病后進行預測是不簡單的。還好的是，強直性脊柱炎不會影響到患者的生命，對于愈后來說也頗為良好。只有及早地發現、治療與控制病程，才能更好的提高治愈后的生命質量，擁有陽光的生活。由此同時，HLA-B27檢測還可以預防AS，對B27陽性患者的一級親屬進行檢測，倘若陽性，也可盡早的診斷，為此進行早干預早治療，減輕病情[23]。

隨著我們對研究的深入，將更全面地了解AS的發病機制，繼而為AS的治療提供依據。隨著科學技術的發展及對此機制的不斷深入，AS的治療可推向更廣闊的領域[24]。

4 總結與展望

強直性脊柱炎是一種慢性炎癥性疾病，是由多因素多水平共同參與的。目前依然無法證實該病發生的確切病因。但該病與HLA-B27有極強的相關性，給診斷疾病帶來了新的曙光。本文詳盡地闡明了臨床實驗室對HLA-B27基因檢測手段的歷史進展過程，毫無疑問，一項準確便捷的檢驗手段對該病的治療將起到至關重要的作用。

當然，科技的進步不會止步于當下，隨著其他理念和技術的不斷革新，筆者有理由相信，將會有更多圍繞強直性脊柱炎的基因被發現，加之對HLA-B27基因更加深入的了解，將會形成一個多基因全方位的評估檢驗體系，屆時將會出現更準確快捷診斷疾病的方法，既減輕了醫務工作者的負擔，同時也給患者帶來福音。