前交叉韌帶損傷后膝關節腔uPA含量變化及意義

吳 波，梁曉松，羅永忠，姜曉玲，孫 磊

基礎醫學

前交叉韌帶損傷后膝關節腔uPA含量變化及意義

吳 波，梁曉松，羅永忠，姜曉玲，孫 磊＊

目的 探討前交叉韌帶損傷后膝關節腔內u－PA變化情況及意義。方法40只新西蘭兔一期建立單側前交叉韌帶損傷模型。損傷術后2周、3周和4周時采用ELISA方法檢測膝關節液中u－PA含量變化。損傷術后3周時采用HE染色和免疫組織化學檢測關節腔內滑膜組織病理變化和u－PA表達情況。結果前交叉韌帶損傷后膝關節腔內u－PA生成增加，術后3周時關節腔內u－PA含量明顯高于假手術組（P＜0.05）。術后3周時組織學檢測顯示滑膜組織病理變化明顯，滑膜組織內u－PA廣泛表達、陽性細胞數量增多（P＜0.01）。結論前交叉韌帶損傷后膝關節腔內u－PA含量增加，可能與滑膜組織病理改變有關。

前交叉韌帶損傷；尿激酶型纖溶酶原激活物（u－PA）；滑膜；兔

前交叉韌帶損傷 （anterior cruciate ligament，ACL）是常見的膝關節韌帶損傷，損傷后韌帶通常不能自行愈合，但其具體機制尚不清楚［1］。近年來，隨著研究深入人們逐漸認識到除了力學因素以外，韌帶損傷后關節腔內生物學微環境同時發生變化，并對韌帶損傷愈合產生重要影響。Murray等［2］觀察到ACL損傷后缺損部位始終未見修復組織充填，指出這可能與損傷后關節腔微環境變化有關。尿激酶型纖溶酶原激活物 （urokinase－type plasminogen activator，u－PA）是對纖維蛋白組織形成起關鍵調節作用，同時還與炎癥反應、基質降解等多種病理過程有關［3］。目前，人們對ACL損傷后膝關節腔內u－PA的變化尚不清楚，本文擬通過動物實驗初步探討ACL損傷后u－PA的變化及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 兔u－PA ELISA試劑盒（上海朗頓），u－PA一抗 （武漢博士德），自動酶標分析儀 （美國BioRAD），切片機（德國Leica），顯微鏡系統（日本Olympus），IPP醫學圖像分析系統 （美國 Media Cybernetics）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及手術 新西蘭大白兔40只，體質量（3.0±0.2）kg，雌雄各半，山東魯抗提供。取36只為實驗對象，接受ACL手術處理。研究對象按時間點隨機分為三組，即2周、3周及4周組，每組各12只。另外4只為假手術組作為對照。實驗組對象均接受單側ACL橫斷處理。麻醉起效后，消毒鋪單，做膝前正中切口，切開內側支持帶，脫位髕骨，顯露關節腔，在ACL實質部將其完全橫斷并做2 mm缺損，沖洗關節腔，逐層縫合，關閉切口。術后常規預防感染，患肢不固定，分籠飼養，正常飲食，自由活動，觀察進食、活動及切口愈合情況。假手術組僅行關節切開術。

1.2.2 關節液u-PA含量檢測 分別于ACL損傷術后2周、3周和4周時，取相應實驗組對象的關節液進行檢測，并取假手術組關節液作為對照。采用ELISA試劑盒檢測不同時間點各組關節液內u－PA含量變化情況。

1.2.3 組織形態學檢測 ACL損傷術后3周時，處死實驗組和假手術組對象取滑膜組織進行HE染色、免疫組織化學檢測，觀察滑膜組織病理學變化和u－PA表達情況。每張切片取5個高倍視野（10× 40）觀察計數，比較u－PA陽性細胞數量變化情況。

1.3 統計學分析 通過IPP醫學圖像系統進行檢測，采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。計量資料以表示。采用方差分析比較各組之間關節液u－PA含量差異，采用t檢驗比較滑膜組織內u－PA陽性細胞數量變化情況，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組別之間關節液u-PA含量變化情況采用ELISA方法檢測ACL損傷術后2周、3周、4周組及假手術組實驗對象關節液u－PA水平 （表1）。研究結果顯示，各組對象之間關節液內u－PA水平差異明顯（P＜0.01）。尤其是，在ACL損傷后3周時關節液中u－PA水平明顯高于假手術組 （P＜0.05）。

表1 ACL損傷后不同時間點關節腔u-PA水平變化（）

組別 n u－P A水平（n g / m l）2周組 1 2 1 4 1 5.2 9 ± 2 3 9.0 6 3周組 1 2 1 7 3 4.7 6 ± 2 4 2.9 5 4周組 1 2 1 5 0 5.8 6 ± 1 6 1.5 5假手術組 4 1 4 6 5.1 7 ± 2 1 4.1 1

2.2 病理學檢測 ACL損傷后3周時，HE染色結果顯示膝關節腔內滑膜大量增生，滑膜組織明顯增厚，其內有大量細胞增殖和血管形成。假手術組滑膜菲薄，未見炎性細胞浸潤及血管增生。研究結果提示ACL損傷后關節腔內滑膜組織出現炎性增生的病理變化。

2.3 滑膜組織u-PA表達情況 ACL損傷后3周時，研究采用免疫組化檢測滑膜組織內u－PA陽性表達情況。研究結果顯示，損傷后增生滑膜組織內可見u－PA廣泛表達，大量陽性細胞聚集。相反地，假手術組滑膜內u－PA呈低水平表達，陽性細胞稀少。實驗組滑膜組織內u－PA陽性細胞數較對照組明顯增高 （37.5±6.8/HPF v.s 4.2±1.9/HPF，P＜0.01）（圖1）。研究表明，ACL損傷后病理狀態下滑膜組織內u－PA表達水平明顯增高。

3 討論

目前臨床上通常采用韌帶重建方法治療ACL損傷，但是仍然存在著腱骨愈合、止點重塑、本體感覺恢復等問題尚未徹底解決。因此，深入研究ACL損傷愈合機制，對進一步提高ACL損傷治療效果有著重要意義。早期有研究發現ACL損傷后韌帶組織也表現出損傷修復變化，經歷炎癥反應、細胞長入，滑膜增生、血管形成及細胞增殖、韌帶塑形等過程。然而，損傷韌帶最終僅形成被滑膜組織包裹的殘跡，而未能形成有效的組織連接［4］。內側副韌帶損傷后韌帶通常能夠較好地自我愈合，在其損傷修復區域可見纖維蛋白組織形成。這種重要的修復組織充填可以為后續修復細胞長入、增殖提供必要場所。然而，即使是在力學穩定的ACL中央型損傷模型中，韌帶損傷部位也未能形成纖維組織充填［2，5］。由此可見，除了力學穩定性之外，ACL損傷后關節腔內生物學微環境也發生改變，并對韌帶損傷修復產生重要影響。

纖維蛋白組織形成是一種普遍的病理現象，廣泛存在于血液凝結、血栓形成、炎癥反應和組織修復等多種病理變化過程中。皮膚、肝和骨組織等組織損傷修復區域均可見纖維蛋白組織形成［6］。纖維蛋白形成和降解之間存在著動態平衡，不同病理狀態下這種平衡可能發生改變。纖維蛋白組織降解受到纖維蛋白溶酶的調控，纖維蛋白溶酶原在纖維蛋白溶酶原激活物調控下轉變為具有酶活性的纖維蛋白溶酶。u-PA是一種絲氨酸蛋白酶，能夠水解纖維蛋白溶酶原轉變為纖維蛋白溶酶。u-PA不僅在纖維蛋白溶解過程中起著關鍵作用，還在炎癥反應、基質降解、細胞遷移、組織修復及腫瘤轉移等多種病理過程中起著重要作用［7，8］。

Murray等［2］曾指出膝關節液中纖溶酶可能影響了韌帶損傷區域內纖維蛋白組織的形成。本文研究結果顯示ACL損傷后關節液內u-PA含量水平明顯增高，關節腔內滑膜組織大量增生、細胞增多，并且高水平表達u-PA。研究結果表明，ACL損傷后關節腔內生物學微環境發生重要變化，u-PA可能對韌帶損傷修復過程產生不利影響。相關研究還發現u-PA與多種關節疾病密切相關。王維山等［9］研究發現膝骨性關節炎患者血漿和關節液中u-PA含量水平明顯高于正常體檢者。另外有研究顯示炎性因子IL-1β能夠通過JNK-Akt-F-κB a信號通路刺激人軟骨細胞u-PA表達增強，可能與膝骨性關節炎病理改變有關［10］。Yang等［11］研究發現非甾體抗炎藥可通過抑制損傷軟骨u-PA形成、減少滑膜反應，進而對骨性關節炎起保護作用。

上述相關研究表明在疾病、損傷等病理狀態下膝關節腔微環境內u-PA形成增加，與組織損傷修復、關節破壞、疾病發展等密切相關。本文研究表明ACL損傷后關節腔內生物學微環境發生改變，關節內u-PA含量水平增高，可能與關節內滑膜組織增生有關。本項目研究對進一步加深ACL損傷修復過程認識，提高其治療效果有著重要意義。

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［11］Yang SF，Hsieh YS，Lue KH，et al.Effects of nonsteroidal antiinflammatory drugs on the expression of urokinase plasminogen activator and inhibitor and gelatinases in the early osteoarthritic knee of humans［J］.Clin Biochem，2008，41（1/2）：109-116.

［2016－02－16收稿，2016－03－14修回］ ［本文編輯：韓仲琪］

The levels change and its significance of urokinase-type plasminogen activator in articular cavity after anterior cruciate ligament injury

WU Bo①，LIANG Xiao－song，LUO Yong－zhong，etal.Department of Orthopaedics，the 88th Hospital of Chinese PLA，Taian，Shandong 271000，China

Objective To investigate the levels change and its significance of urokinase－type plasminogen activator in articular cavity after anterior cruciate ligament injury.MethodsForty New Zealand rabbits were employed in this study and the transection of anterior cruciate ligament was created in the unilateral knee.The concentrations of urokinase－type plasminogen activator in joint fluid were detected by ELISA postoperatively at 2，3，and 4 weeks after injury.At 3 weeks after injury the pathological change and expression of urokinase－type plasminogen activator were further evaluated in the synovium.ResultsThe level of urokinase－type plasminogen activator in joint fluid had dramatically changed.The levels of urokinase－type plasminogen activator were significantly elevated at 3 weeks after injury than that of sham operation group（P＜0.05）.At 3 weeks after injury the pathological changes were proven significant in the synovium.Moreover，in the synovium the expression of urokinase－type plasminogen activator was elevated and the number of the positive cells markedly increased（P＜0.01）.ConclusionThe levels of urokinase－type plasminogen activator in the knee joint are significantly increased which may be related to the pathological changes of the synovium.

Anterior cruciate ligament injury；Urokinase－type plasminogen activator（u－PA）；Synovium；Rabbit

R686：R684

A

10.14172/j.issn1671－4008.2016.08.020

山東省自然科學基金資助項目（ZR2014HQ010；ZR2013 HM010）

271000山東泰安，解放軍88醫院全軍骨科中心 （吳波，梁曉松，羅永忠，孫磊），病理科（姜曉玲）

孫磊，Email：sl88h@163.com