藥物誘導自噬對慢性髓系白血病細胞的作用及其機制研究進展

劉慧敏，陳亦雨，賀艷杰，李玉華

(南方醫科大學珠江醫院，廣州510280)

藥物誘導自噬對慢性髓系白血病細胞的作用及其機制研究進展

劉慧敏，陳亦雨，賀艷杰，李玉華

(南方醫科大學珠江醫院，廣州510280)

慢性髓系白血病(CML)是一種起源于造血干細胞的惡性克隆性腫瘤，其藥物治療常伴隨自噬激活。一方面自噬可以對白血病細胞產生保護作用，維持細胞生存；另一方面自噬可以誘導白血病細胞的凋亡。合理聯合應用自噬調節劑對CML的治療可能會有益。

自噬；慢性髓系白血病；藥物療法；自噬調節劑

慢性髓系白血病(CML)是以9號染色體與22號染色體異位生成斷裂點簇區/阿伯爾森1(BCR-ABL1)基因為特征的一種造血干細胞惡性克隆性疾病，約占成人新診斷白血病的15%。靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKI)伊馬替尼(IM)的問世是CML治療史上的里程碑，使CML成為藥物可控的慢性疾病，但仍有近20%的CML經IM治療無法達到完全緩解，而且加速期和急變期患者對IM耐藥已成為臨床上的普遍現象。IM耐藥機制復雜，包括BCR-ABL1基因激酶域或非激酶域點突變、BCR-ABL1基擴增及藥物泵高表達等[1]。第二代TKI尼洛替尼和達沙替尼可克服部分耐藥現象，但對T315I(位于BCR-ABL1基因激酶域)突變的CML患者無效。第三代TKI帕那替尼克服了T315I突變導致的耐藥，但不良反應嚴重。自噬是發生在真核細胞中的一種保守機制，基礎水平的自噬可維持細胞穩態和能量平衡。在饑餓、缺氧、藥物刺激、放射、病原體入侵等不利條件下，自噬被高度激活，一方面通過降解受損細胞器和錯誤折疊的蛋白減輕炎癥反應導致的進一步損傷，另一方面可將氨基酸、脂肪酸等降解產物供細胞循環利用，幫助細胞克服應激[2]。自噬對CML細胞的生存具有兩面性：一方面產生保護性作用，維持白血病細胞存活；另一方面可以促進白血病細胞凋亡。現將藥物誘導自噬對CML的作用及機制、自噬調節劑的作用機制等相關研究進展情況綜述如下。

1 自噬與腫瘤

自噬在腫瘤的發生發展中有雙重作用[3]。腫瘤多發生在器官或組織受損的基礎上。自噬能幫助細胞清除有害物質，維持基因組穩定性。但如果自噬缺陷則增加基因錯誤修復發生率，削弱細胞和機體對抗應激的能力，促進腫瘤發生。腫瘤完全形成后，自噬將發揮促進腫瘤進一步惡化的作用，原因在于腫瘤細胞的過速增殖伴隨大量正常細胞的死亡和干細胞的激活，并導致局部缺血缺氧，此時腫瘤細胞依靠自噬緩解高代謝壓力，抵抗不良環境，繼而存活。

2 藥物誘導自噬對CML細胞的作用及其機制

自噬在腫瘤治療中的作用同樣也有雙面性。諸多化療藥物可誘導自噬，這可能與藥物導致的細胞應激有關。一方面藥物誘導自噬可能是腫瘤的自我保護機制，另一方面藥物可誘導腫瘤細胞發生自噬性死亡。藥物誘導自噬在促進細胞生存或死亡這兩者之間的選擇和轉換可能與細胞類型、腫瘤分期、基因背景以及腫瘤微環境有關。

2．1 藥物誘導自噬對CML細胞的保護作用及其機制 多種藥物可誘導CML細胞發生保護性自噬，包括TKI和非TKI。

2.1.1 TKI誘導自噬對CML細胞的保護作用及其機制 TKI可激活自噬，并對CML細胞起保護作用。Mishima等[4]研究發現，IM誘導CML來源的K562細胞發生自噬，抑制自噬后不僅增強IM對野生型BCR-ABL1基因細胞的毒性效應，而且促進BCR-ABL1基因T315I突變的細胞死亡，該研究提示抑制自噬可克服頑固諸如T315I點突變導致的IM耐藥。

CML干細胞對IM不敏感，使得殘留的干細胞在停藥后快速增殖，這是CML復發的根本原因。Crowley等[5]研究發現，IM停藥后CML細胞的活力恢復伴隨高水平自噬，抑制自噬可逆轉這一現象。此外有研究[6]發現，自噬相關基因ATG4B在耐藥的白血病干/祖細胞中高表達，敲除ATG4B基因可以抑制自噬，使CML干細胞對IM的敏感性增加。以上研究結果提示抑制自噬有可能成為消除CML微小殘留病灶的新策略。

IM如何誘導自噬？自噬又如何促進CML細胞存活？其機制仍未完全闡明。Sheng等[7]認為內源性BCR-ABL1基因可持續激活Akt/mTOR通路并負性調節自噬，而IM可能通過抑制BCR-ABL1/PI3K/AKT/FOXO4/ATF5/mTOR通路誘導自噬。Bellodi等[8]研究發現，IM誘導自噬與內質網應激以及鈣流動態平衡有關。Mancini等[9]也得到了類似的結論，并發現β-catenin 75 kDa剪接體參與IM誘導自噬的過程。筆者所在課題組前期研究發現IM誘導小鼠CML細胞32D-p210T315I和S4C2-1自噬流水平升高，且其mTOR及其下游分子p-4EBP1和p-70S6K表達減少，提示該自噬過程可能依賴mTOR表達。以上研究結果表明IM可通過自噬導致CML細胞耐藥，采用IM聯合自噬抑制劑的治療方案有望增強療效。

隨著第二、三代TKI的廣泛應用，對自噬的研究擴展到IM以外的其他靶向治療藥物。Bafetinib是一種BCR-ABL1/Lyn雙重抑制劑，可強烈誘導保護性自噬[10]。新型酪氨酸激酶抑制劑Thiotanib使CML細胞自噬水平升高，可能與Thiotanib抑制AKT/mTOR通路、激活Erk、促進Beclin 1與Bcl-2解耦聯，形成自噬核心復合體Beclin1/Vps34等機制有關[11]。這些研究結果證實TKI可誘導保護性自噬，而抑制自噬有可能增強TKI的療效，促進CML細胞死亡。

2.1.2 非TKI誘導自噬對CML細胞的保護作用及及其機制 非TKI也可誘導保護性自噬。α干擾素(IFNα)是前TKI時代廣泛用于CML治療的藥物，近年來由于TKI療效不足的顯現，IFNα又重新引起學者關注。IFNα通過JAK1-STAT1和RELA通路激活Beclin1，誘導自噬，而抑制自噬可激活Caspase8-Bid通路，增強IFNα的促凋亡作用[12]。

組蛋白乙酰化水平異常在白血病的發生發展中至關重要，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(SAHA)可通過周期阻滯、凋亡誘導、新生血管抑制等機制發揮其抗腫瘤活性。Carew等[13]研究發現，SAHA使CML細胞的自噬水平顯著升高，抑制自噬通過促進溶酶體蛋白酶D向胞質轉移而增強SAHA的促凋亡作用。

白血病細胞耐藥與Hedgehog(Hh)通路持續活化有關。Zeng等[14]發現抑制Hh通路也可誘導CML細胞發生自噬，聯用自噬抑制劑可顯著降低耐藥細胞的活性，并降低BCR-ABL1蛋白表達水平，對正常的外周血單個核細胞殺傷作用小。

2.2 藥物誘導自噬對CML細胞自噬性死亡的作用及其機制 適當程度的自噬可以幫助細胞應對不良條件，度過危機，但過度激活自噬將耗竭細胞內的物質和能量，即發生“自食”現象，促進細胞走向衰亡。Elzinga等[15]認為IM誘導自噬形成的自噬體可隔離BCR-ABL1蛋白，并進一步將其降解。Goussetis等[16]發現三氧化二砷可以通過自噬功能蛋白p62/SQSTM1將BCR-ABL1蛋白錨定于自噬溶酶體，再通過組織蛋白酶cathepsin B將其降解，抑制自噬或阻止BCR-ABL1蛋白的降解。以上研究提示藥物可能通過誘導自噬降解BCR-ABL1蛋白，抑制細胞活性。

活性氧簇(ROS)是細胞代謝產生的強反應活性分子，也是誘導細胞自噬發生的重要原因。研究[17]發現，脂肪酸衍生物AIC-47通過PPAR/Catenin/BCR-ABL/mTOR/hnRNP/PKM通路使ROS生成增多，進一步導致CML細胞發生自噬性死亡。

多種草本植物提取物都有良好的抗腫瘤效果，其對CML的作用也受到廣泛關注，如白藜蘆醇通過激活JNK通路使p62/SQSTM1蛋白聚集，同時上調AMPK表達，抑制mTOR通路，解除mTOR對自噬的抑制作用，從而誘導細胞走向自噬性死亡[18]。

近年來溶瘤腺病毒在腫瘤中的應用研究成為熱點，其作用機制在于激活腫瘤細胞的凋亡通路。Tong等[19]構建了過表達自噬基因Beclin 1的重組溶瘤腺病毒SG511-BECN，該病毒對正常細胞毒性極小，但可以強烈誘導CML原始細胞死亡，而干擾自噬基因UVRAG、ATG5和ATG7。該研究揭示了自噬在溶瘤腺病毒治療中的作用。

3 自噬調節劑的作用機制

3.1 自噬抑制劑 化療藥物聯合自噬抑制劑的治療方案可增加腫瘤對化療藥物的敏感性。不同的自噬抑制劑的作用機制不同，主要有以下三方面：①抑制溶酶體功能：自噬底物降解需要溶酶體水解酶的參與，溶酶體烷化劑氯喹和羥氯喹可通過中和溶酶體囊泡的酸性而抑制該過程。氯喹衍生物Lys05和Monensin有更強的親溶酶體性，可發揮更加顯著的自噬抑制作用[20]。目前羥氯喹聯合IM治療CML的Ⅱ期臨床試驗正在進行中，有望成為CML治療的重大突破。②調節PI3K活性：哺乳動物有三型PI3K。ClassⅠPI3K促進mTOR活化，抑制自噬；Class Ⅲ PI3K是酵母細胞中液泡分選蛋白 34(Vps34)在哺乳動物中的同源物，其與酵母自噬基因Beclin1、Vps15/p150、 ATG14L以及抗紫外線相關基因等形成自噬核心復合物，正性調節自噬。LY294002、渥曼青霉素、3-甲基腺嘌呤(3-MA)可同時抑制ClassⅠPI3K和Class Ⅲ PI3K，但通常對Class Ⅲ PI3K的抑制作用更強，故其作為自噬抑制劑被廣泛應用。然而，近年來有研究[21]發現10 mmol/L的3-MA在體外可有效抑制自噬體形成，但相同劑量的3-MA在體內卻促進自噬的發生，原因可能是3-MA在體內對ClassⅠPI3K的抑制作用更強。小分子化合物Spautin-1是一種新型強效自噬抑制劑，可通過靶向泛素特異性蛋白酶USP10和USP13促進Beclin1和Vps34降解，進而抑制自噬。Shao等[22]發現Spautin-1可逆轉CML細胞對IM的耐藥。此外，Mill等[23]設計了一系列靶向Vps34的化合物，如PT21等，將有望作為特異性自噬抑制劑得到應用。③調節細胞內鈣水平：鈣離子是細胞信號轉導過程中的第二信使，參與多種信號通路調控，在自噬發生過程中也有不可或缺的作用。Ganley等[24]發現毒胡蘿卜內酯可通過干擾鈣離子穩態抑制自噬。

3.2 自噬激動劑 對于化療藥物誘導的自噬，我們可以通過聯用自噬激動劑進一步增強自噬反應，更快更徹底殺滅腫瘤細胞。雷帕霉素通過抑制mTORC1活性，誘導自噬。新型mTOR抑制劑PP242和Torin 1可同時抑制mTORC1和mTORC2而誘導自噬[25]。

Obatoclax是一種BH3域類似物，也參與自噬調控，可能機制是Obatoclax通過抑制Bcl-2和Mcl，解除與Beclin1的耦聯作用，促進自噬[26]。Bonapace等[27]發現將Obatoclax與糖皮質激素聯用可顯著抑制mTOR底物表達，觸發耐糖皮質激素的ALL細胞發生自噬性死亡。

綜上所述，在CML治療過程中，多種藥物可誘導CML細胞發生自噬，但相應的生物學效應卻不盡相同，既有可能促進CML細胞存活，也有可能加速CML細胞死亡。這一現象與自噬水平高低、自噬所處時期、CML的發展階段、CML細胞所處的微環境、藥物種類及作用機制等息息相關。深入探索現有藥物對自噬的調節作用，同時開發特異性的小分子自噬調節藥物，將其與化療聯合應用，抑制保護性自噬或誘導自噬性死亡，將有望為CML的治療帶來新的契機。

[1] Huang R, Kang Q, Liu H, et al. New insights into the molecular Resistance mechanisms of chronic myeloid leukemia[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2016,16(4):323-345.

[2] Filomeni G, De Zio D, Cecconi F. Oxidative stress and autophagy: the clash between damage and metabolic needs[J]. Cell Death Differ, 2015,22(3):377-388.

[3] Cheong H. Integrating autophagy and metabolism in cancer[J]. Arch Pharm Res, 2015,38(3):358-371.

[4] Mishima Y, Terui Y, Mishima Y, et al. Autophagy and autophagic cell death are next targets for elimination of the resistance to tyrosine kinase inhibitors[J]. Cancer Sci, 2008,99(11):2200-2208.

[5] Crowley LC, Elzinga BM, O′Sullivan GC, et al. Autophagy induction by Bcr-Abl-expressing cells facilitates their recovery from a targeted or nontargeted treatment[J]. Am J Hematol, 2011,86(1):38-47.

[6] Rothe K, Lin H, Lin KBL, et al. The core autophagy protein ATG4B is a potential biomarker and therapeutic target in CML stem/progenitor cells[J]. Blood, 2014,123(23):3622-3634.

[7] Sheng Z, Ma L, Sun JE, et al. BCR-ABL suppresses autophagy through ATF5-mediated regulation of mTOR transcription[J]. Blood, 2011,118(10):2840-2848.

[8] Bellodi C, Lidonnici MR, Hamilton A, et al. Targeting autophagy potentiates tyrosine kinase inhibitor-induced cell death in Philadelphia chromosome-positive cells, including primary CML stem cells[J]. J Clin Invest, 2009,119(5):1109-1123.

[9] Mancini M, Leo E, Campi V, et al. A calpain-cleaved fragment of β-catenin promotes BCRABL1+cell survival evoked by autophagy induction in response to imatinib[J]. Cell Signal, 2014,26(8):1690-1697.

[10] Kamitsuji Y, Kuroda J, Kimura S, et al. The Bcr-Abl kinase inhibitor INNO-406 induces autophagy and different modes of cell death execution in Bcr-Abl-positive leukemias[J]. Cell Death Differ, 2008,15(11):1712-1722.

[11] Fan J, Dong X, Zhang W, et al. Tyrosine kinase inhibitor Thiotanib targets Bcr-Abl and induces apoptosis and autophagy in human chronic myeloid leukemia cells[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014,98(23):9763-9775.

[12] Zhu S, Cao L, Yu Y, et al. Inhibiting autophagy potentiates the anticancer activity of IFN1α/IFNα in chronic myeloid leukemia cells[J]. Autophagy, 2014,9(3):317-327.

[13] Carew JS, Nawrocki ST, Kahue CN, et al. Targeting autophagy augments the anticancer activity of the histone deacetylase inhibitor SAHA to overcome Bcr-Abl-mediated drug resistance[J]. Blood, 2007,110(1):313-322.

[14] Zeng X, Zhao H, Li Y, et al. Targeting Hedgehog signaling pathway and autophagy overcomes drug resistance of BCR-ABL-positive chronic myeloid leukemia[J]. Autophagy, 2015,11(2):355-372.

[15] Elzinga BM, Nyhan MJ, Crowley LC, et al. Induction of autophagy by Imatinib sequesters Bcr-Abl in autophagosomes and down-regulates Bcr-Abl protein[J]. Am J Hematol, 2013,88(6):455-462.

[16] Goussetis DJ, Gounaris E, Wu EJ, et al. Autophagic degradation of the BCR-ABL oncoprotein and generation of antileukemic responses by arsenic trioxide[J]. Blood, 2012,120(17):3555-3562.

[17] Shinohara H, Taniguchi K, Kumazaki M, et al. Anti-cancer fatty-acid derivative induces autophagic cell death through modulation of PKM isoform expression profile mediated by bcr-abl in chronic myeloid leukemia[J]. Cancer Lett, 2015,360(1):28-38.

[18] Puissant A, Robert G, Fenouille N, et al. Resveratrol promotes autophagic cell death in chronic myelogenous leukemia cells via JNK-Mediated p62/SQSTM1 expression and AMPK activation[J]. Cancer Res, 2010,70(3):1042-1052.

[19] Tong Y, You L, Liu H, et al. Potent antitumor activity of oncolytic adenovirus expressing Beclin-1 via induction of autophagic cell death in leukemia[J]. Oncotarget, 2013,4(6):860-874.

[20] Amaravadi RK, Winkler JD. Lys05: a new lysosomal autophagy inhibitor[J]. Autophagy, 2012,8(9):1383-1384.

[21] Wu YT, Tan HL, Shui G, et al. Dual role of 3-methyladenine in modulation of autophagy via different temporal patterns of inhibition on class I and Ⅲ phosphoinositide 3-kinase[J]. J Biol Chem,2010, 285(14):10850-10861.

[22] Shao S, Li S, Qin Y, et al. Spautin-1, a novel autophagy inhibitor, enhances imatinib-induced apoptosis in chronic myeloid leukemia[J]. Int J Oncol, 2014,44(5):1661-1668.

[23] Miller S, Tavshanjian B, Oleksy A, et al. Shaping development of autophagy inhibitors with the structure of the lipid kinase Vps34[J]. Science, 2010,327(5973):1638-1642.

[24] Ganley IG, Wong PM, Gammoh N, et al. Distinct autophagosomal-lysosomal fusion mechanism revealed by thapsigargin-induced autophagy arrest[J]. Mol Cell, 2011,42(6):731-743.

[25] Hsieh AC, Costa M, Zollo O, et al. Genetic dissection of the oncogenic mTOR pathway reveals druggable addiction to translational control via 4EBP-eIF4E[J]. Cancer Cell, 2010,17(3):249-261.

[26] Sharma A, Singh K, Mazumder S, et al. BECN1 and BIM interactions with MCL-1 determine fludarabine resistance in leukemic B cells[J]. Cell Death Dis, 2013,4(5):628.

[27] Bonapace L, Bornhauser BC, Schmitz M, et al. Induction of autophagy-dependent necroptosis is required for childhood acute lymphoblastic leukemia cells to overcome glucocorticoid resistance[J]. J Clin Invest, 2010,120(4):1310-1323.

國家自然科學基資助項目(81372249)；國家自然科學基金青年科學基金資助項目(81300431)。

李玉華(E-mail: liyuhua2011gz@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.036

R733.72；R551.3

A

1002-266X(2016)43-0108-04

2016-07-23)