絕經后骨質疏松癥患者血漿SOST表達變化及其與基因甲基化的關系

時宇博，朱福良，李立軍，王云國，宗強，倪東馗

(天津醫科大學第二醫院，天津300211)

·臨床研究·

絕經后骨質疏松癥患者血漿SOST表達變化及其與基因甲基化的關系

時宇博，朱福良，李立軍，王云國，宗強，倪東馗

(天津醫科大學第二醫院，天津300211)

目的 觀察絕經后骨質疏松癥患者血漿SOST基因表達變化，并探討其與基因甲基化的關系。方法 選擇絕經后骨質疏松癥者60例(觀察組)，絕經后無骨質疏松癥患者60例(對照組)。采集兩組空腹外周血，采用實時定量PCR法檢測血漿SOST mRNA相對表達量，甲基化特異性-PCR法檢測SOST基因甲基化情況，分析SOST mRNA表達與其基因甲基化的關系。結果 觀察組及對照組SOST mRNA相對表達量分別為(6.126±0.304)×10-5、(1.936±0.358)×10-5，兩組比較P<0.05；SOST基因甲基化陽性率分別為66.67%(40/60)、83.33%(50/60)，兩組比較P<0.05。觀察組SOST基因甲基化陽性及陰性者mRNA相對表達量分別為(1.725±0.046)×10-5、(4.253±0.039)×10-5，SOST基因甲基化陽性陽性率與其mRNA表達呈負相關(r=-0.996，P<0.01)。對照組SOST基因甲基化陽性及陰性者mRNA相對表達量分別為(1.362±0.091)×10-5、(5.251±0.042)×10-5，SOST基因甲基化率與其mRNA表達呈負相關(r=-0.985，P<0.01)。結論 絕經后骨質疏松癥患者血漿SOST mRNA表達升高，可能與其基因低甲基化有關。

骨質疏松癥；SOST基因；甲基化；絕經；女性

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨的微觀結構退化為特征，致使骨的脆性增加，易于發生骨折的全身性骨骼疾病。骨質疏松癥是一種復雜的多基因遺傳病,其遺傳率為60%～80%[1]。SOST基因位于人類基因組的17q12-21,主要在骨細胞中表達,含有兩個外顯子和一個內含子,編碼硬化蛋白[2]。硬化蛋白能夠抑制骨分化和形成過程中的Wnt信號途徑，抑制硬化蛋白的表達能夠促進骨形成[3，4]。本研究觀察絕經后骨質疏松癥患者血漿SOST mRNA表達變化，并探討其與基因甲基化的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年5～8月我院收治的絕經后骨質疏松癥者60例(觀察組)，年齡(57±2)歲；絕經后無骨質疏松癥患者60例(對照組)，年齡(56±1)歲。骨質疏松癥參照WHO推薦的診斷標準。排除標準：①合并糖尿病、甲狀腺功能亢進、甲狀旁腺功能亢進等影響骨代謝的內分泌疾病者；②合并肝腎功能異常、胃炎、腸炎、類風濕性關節炎、派杰氏病或骨腫瘤等惡性腫瘤者；③半年內曾使用過激素或其他影響骨代謝的藥物者；④1年內發生骨折等導致肢體運動功能受限者。本研究通過醫院倫理委員會審查，且患者知情同意。

1.2 相關指標觀察

1.2.1 血漿SOST mRNA表達 采用實時定量PCR法。兩組空腹12 h以上，于次日清晨8～9點取靜脈血2 mL，均采用EDTA抗凝。采用TRIzol一步法快速提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA。以GAPDH為內參基因，實時定量PCR反應采用Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG試劑盒，使用ABI 7500 Sequence Detector儀器及分析系統進行擴增和分析。反應體系包括cDNA、Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG及上游引物、下游引物。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min，共35個循環。每個樣本重復檢測兩次。SOST mRNA相對表達量以2-ΔΔCT表示。

1.2.2 SOST基因甲基化情況 按照DNA提取試劑盒說明書進行操作，提取DNA后進行定量，根據甲基化試劑盒說明書對所提取的DNA進行亞硫酸鹽修飾和純化。采用甲基化特異性-PCR法檢測SOST基因甲基化情況，按試劑盒說明書操作。所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成，反應體系：亞硫酸鹽處理的DNA，10×PCR buffer，上下游引物，2.5 mmol/L dNTP，Taq DNA Polymerase，加入ddH2O至總體積為25 μL。甲基化和非甲基化反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min，共45個循環。

2 結果

2.1 兩組血漿SOST mRNA相對表達量比較 觀察組SOST mRNA相對表達量為(6.126±0.304)×10-5，對照組為(1.936±0.358)×10-5，兩組比較P<0.05。

2.2 兩組SOST基因甲基化情況比較 觀察組SOST基因甲基化陽性40例、陰性20例，甲基化陽性率為66.67%；對照組SOST基因甲基化陽性50例、陰性10例，甲基化陽性率為83.33%；兩組比較P<0.05。

2.3 SOST mRNA表達與甲基化的關系 觀察組SOST基因甲基化陽性者mRNA相對表達量為(1.725±0.046)×10-5，陰性者為(4.253±0.039)×10-5，SOST基因甲基化陽性率與其mRNA表達呈負相關(r=-0.996，P<0.01)。對照組SOST基因甲基化陽性者mRNA相對表達量為(1.362±0.091)×10-5，陰性者為(5.251±0.042)×10-5，SOST基因甲基化陽性率與其mRNA表達呈負相關(r=-0.985，P<0.01)。

3 討論

Loots等[5]研究顯示，骨肥大癥患者SOST基因下游35 kb處存在一個52 kb的缺失，表明SOST基因在成人骨骼中是必需的。Li等[6]以9～10周SOST基因敲除小鼠和野生型小鼠為研究對象，通過放射性技術檢測其骨折愈合程度，結果發現基因敲除更有利于胼胝體橋的形成，并增強骨和骨組織的形成。在治療骨質疏松癥和相關的低密度骨骼疾病的研究中，SOST基因逐漸受到越來越多的關注[7～9]。

SOST基因的表達具有特異性，胚胎時期可以在多種組織中表達，成年人或鼠中只在骨細胞特異性表達，是調控成骨細胞功能的一個重要基因[10]。本研究結果顯示，絕經后骨質疏松癥患者血漿SOST mRNA相對表達量明顯高于無骨質疏松癥者，但是其作用機制尚不清楚。骨質疏松癥是一種與年齡有關的疾病，隨著年齡的增長，基因甲基化的模式會發生變化，因此推測基因甲基化可能有助于骨質疏松癥的發生[11，12]。Delgado-Calle等[8]研究發現，SOST基因有兩個CpG富集區,其中一個區域臨近啟動區域外顯子1附近，在成骨細胞中的甲基化程度高于骨細胞。體外研究顯示，SOST基因CpG島的甲基化可阻礙蛋白結合到啟動子區，脫甲基后基因表達顯著上調,也提示基因表達在成骨細胞和骨細胞轉變過程中的作用[13]。

為探討SOST基因表達與其甲基化在絕經后骨質疏松癥發病中的作用，我們檢測了絕經后骨質疏松癥和無骨質疏松癥者血漿的SOST甲基化狀態，結果顯示前者的SOST甲基化陽性率明顯低于后者，與Reppe等[14]研究結論一致；相關性分析顯示，兩組SOST基因甲基化陽性率與其mRNA表達均呈顯著負相關，與Papathanasiou等[15]研究結論一致。提示SOST基因甲基化可引起其mRNA表達發生變化，直接或間接阻礙轉錄因子與啟動子結合，從而降低其轉錄水平，可能是骨質疏松癥發生的機制之一。

綜上所述，絕經后骨質疏松癥患者血漿SOST mRNA表達升高，可能與其低甲基化有關，二者的相互作用在絕經后骨質疏松癥的發生、發展中具有重要意義。本研究為揭示骨質疏松癥的發病機制提供依據，但是關于SOST基因甲基化如何調節其表達的分子機制尚需進一步研究。

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倪東馗(E-mail： chenlyx126@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.011

R174.4

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1002-266X(2016)16-0035-03

2015-09-16)