髓母細胞瘤組織中SIRT6的表達觀察

耿曉華，李明闖，程習輝

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院，鄭州 450007)

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髓母細胞瘤組織中SIRT6的表達觀察

耿曉華，李明闖，程習輝

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院，鄭州 450007)

目的觀察髓母細胞瘤組織中沉默信息調節因子6(SIRT6)的表達變化。方法20例份髓母細胞瘤組織(腫瘤組)，20例份瘤旁正常組織(瘤旁組)，采用RT-PCR法檢測兩組SIRT6 mRNA，Western blotting法檢測SIRT6蛋白。結果腫瘤組、瘤旁組SIRT6 mRNA相對表達量分為0.21±0.16、1.01±0.27，SIRT6蛋白相對表達量分別為0.54±0.14、1.25±0.12，兩組比較，P均<0.05。結論髓母細胞瘤組織中SIRT6 mRNA、蛋白表達降低。

髓母細胞瘤；沉默信息調節因子6

髓母細胞瘤是高度惡性的神經上皮組織腫瘤，也是兒童常見的惡性腫瘤之一，其預后較差，目前發病機制仍不清楚。沉默信息調節因子6(SIRT6)屬Sirtuin家族成員之一[1]，其位于細胞核內，具有去乙酰化酶和ADP-核糖轉移酶活性的作用，在人和小鼠多種組織中都有表達[2]，在人類大腦中亦呈高表達狀態，對神經細胞的萎縮、代謝均有影響[3]。Chen等[4]發現，SIRT6可以抑制神經膠質瘤細胞在體內的生長。目前，關于SIRT6與髓母細胞瘤關系的研究鮮有報道。本研究采取RT-PCR法和Western blotting法分別對髓母細胞瘤組織中SIRT6 mRNA、蛋白進行檢測，以探討其在髓母細胞瘤發生發展中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年1月～2015年7月鄭州大學附屬鄭州中心醫院收治的髓母細胞瘤患者20例，男13例，女7例；年齡5～45歲；病程1周～4個月。所有患者術前均未接受化療、放療及其他治療。手術留取腫瘤組織及瘤旁組織各20例份(分別計為腫瘤組和瘤旁組)。

1.2SIRT6 mRNA檢測方法采用RT-PCR法。兩組分別稱取50 mg組織，在液氮中研磨后移入EP管，加入1 mL TRIzol，冰浴充分勻漿，室溫靜5 min；4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，將上清轉移到新的EP管中。每管中加入200 μL氯仿，渦旋儀劇烈渦旋30 s，冰盒放置3 min；12 000 r/min 離心15 min，取上層無色的水相；加入200 μL異丙醇，反復顛倒混勻，室溫靜置20 min；12 000 r /min離心10 min，保留沉淀；加入預冷的1 mL的75%乙醇，渦旋儀振蕩混勻；4 ℃下以7 500 r/min 離心5 min，小心去除上清，將RNA沉淀置于超凈臺通風干燥處理10 min；每管中加入30 μL去離子水溶解RNA沉淀，-70 ℃凍存備用。采用M-MLV逆轉錄酶反轉錄mRNA后，進行熒光定量PCR檢測，所有操作均按試劑說明書進行。

1.3SIRT6蛋白檢測方法采用Western blotting法。將組織置于液氮中冷凍，后迅速放于研缽中研磨成粉末狀，移入EP管中，加入總蛋白提取液，置于冰上，超聲波振蕩3次，每次10 s，后冰上靜置10 min。置于低溫高速離心機，4 ℃下以10 000 r/min離心5 min，取上清以BCA法測定蛋白濃度。加入溴酚藍后進行變性。配制10%分離膠，取等量樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠，電泳，至溴酚藍跑到膠底部。將聚丙烯酰胺凝膠經過轉膜儀轉至PVDF膜上，用封閉液封閉該PVDF膜60 min，洗膜3次，將轉膜后的膜蛋白面朝下平鋪于保鮮膜上的一抗液中，排除氣泡，常溫搖床孵育，2 h后以TBST清洗，每次10 min。酶標二抗與一抗結合，于凝膠成像系統中曝光。顯色后用Image J分析軟件進行分析，檢測其IOD累積光密度參照值，并計算每組目的蛋白對比內參表達的相對值，以此作為目的蛋白的相對表達量。

2　結果

腫瘤組、瘤旁組SIRT6 mRNA相對表達量分為0.21±0.16、1.01±0.27，SIRT6蛋白相對表達量分別為0.54±0.14、1.25±0.12，兩組比較，P均<0.05。

3　討論

Sirtuins家族為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的組蛋白去乙酰化酶，包含7個成員(SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7)，其分布廣泛，功能復雜多樣[5,6]，SIRT6屬Sirtuin家族成員之一，同時具有去乙酰化酶和ADP-核糖轉移酶活性作用[7]，與神經生長、腫瘤發生有關[3]。目前已經證實，SIRT6參與了包括神經膠質瘤、肝癌、乳腺癌、胰腺癌和結腸癌等[4,8,9]多種腫瘤的發生，且在不同腫瘤中發揮作用不同[10]，而關于髓母細胞瘤中SIRT6mRNA轉錄情況及蛋白表達情況鮮有報道。

本研究顯示，腫瘤組SIRT6 mRNA、蛋白相對表達量低于瘤旁組，表明SIRT6可能參與了髓母細胞瘤的發生。從上述結果可以看出，不管是在轉錄水平，還是在蛋白水平，SIRT6在髓母細胞瘤中的表達明顯低于瘤旁正常組織，提示SIRT6在髓母細胞瘤的發生發展中可能發揮著抑制作用。這與此前報道[4,8,11]SIRT6在肝癌、胰腺癌、神經膠質瘤中表達下調結果一致。SIRT6在腫瘤形成中發揮抑制作用的機制尚不清楚，可能是通過直接與腫瘤抑制因子、致癌蛋白相互作用，調節腫瘤發展或通過調節組蛋白的乙酰化3賴氨酸9致癌基因的啟動子，通過抑制ERK1/2信號通路而抑制腫瘤細胞的增長[4,11～13]。但也有報道[10,14]，SIRT6在某些腫瘤中表達高于正常組織，如前列腺癌、子宮內膜癌。

總之，髓母細胞瘤組織中SIRT6 mRNA及蛋白表達異常，推測其在髓母細胞瘤中可能發揮抑癌作用。

[1] Gil R, Barth S, Kanfi Y, et al. SIRT6 exhibits nucleosomedependent deacetylase activity[J]. Nucleic Acids Res, 2013,41(18):8537-8545.

[2] Kanfi Y, Naiman S, Amir Q, et al. The sirtuin SIRT6 regulates lifespan in male mice[J]. Nature, 2012,483(7388):218-221.

[3] Mostoslavsky R, Chua KF, Lombard DB, et al. Genomic instability and aginglike phenotype in the absence of mammalian SIRT6[J]. Cell, 2006,124(2):315-329.

[4] Chen X, Hao B, Liu Y, et al. The histone deacetylase SIRT6 suppresses the expression of the RNA-binding protein PCBP2 in glioma[J].Biochem Biophys Res Commun, 2014,446(1):364-369.

[5] Metoyer CF, Pruitt K. The role of Sirtuin proteins in obesity[J]. Pathophysiology, 2008,15(2)103-108.

[6] Haigis MC, Guarente LP. Mammalian Sirtuins-emerging roles in physiology, aging and calorie restriction[J]. Genes Dev, 2006,20(21):2913-2921.

[7] Herskovits AZ, Guarente L. Sirtuin deacetylases in neurodegenerative diseases of aging[J]. Cell Res, 2013,23(6):746-758.

[8] Marquardt JU, Fischer K, Baus K, et al. SIRT6 dependent genetic and epigenetic alterations are associated with poor clinical outcome in HCC patients[J]. Hepatology, 2013,58(3):1054-1064.

[9] Khongkow M, Olmos Y, Gong C, et al. SIRT6 modulates paclitaxel and epirubicin resistance and survival in breast cancer[J]. Carcinogenesis, 2013,34(7):1476-1486.

[10] 趙干業,韓麗敏,童坦君.SIRT6功能與疾病研究進展[J].生理科學進展,2014,45(4):299-303.

[11] Sebastián C, Zwaans BM, Silberman DM, et al. The histone deacetylase SIRT6 is a tumor suppressor that controls cancer metabolism[J]. Cell, 2012,151(6):1185-1199.

[12] Lin Z, Yang H, Tan C, et al. USP10 antagonizes c-Myc transcriptional activation through SIRT6 stabilization to suppress tumor formation[J]. Cell Rep, 2013,5(6):1639-1649.

[13] Zhang ZG, Qin CY. Sirt6 suppresses hepatocellular carcinoma cell growth via inhibiting the extracellular signal-regulated kinase signaling pathway[J]. Mol Med Rep, 2014,9(3):882-888.

[14] Kanfi Y, Naiman S, Amir G, et al. The sirtuin SIRT6 regulates lifespan in male mice[J]. Nature, 2012,483(7388):218-221.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.015

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1002-266X(2016)15-0046-02

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