基于丹頂鶴和大鴇病原的分離與鑒定實驗研究

尚麗元劉 蕾高雪霏

(1.吉林莫莫格國家級自然保護區管理局，吉林白城 132000；2.吉林向海國家級自然保護區管理局，吉林通榆 137215；3.吉林莫莫格國家級自然保護區管理局，吉林白城 132000)

基于丹頂鶴和大鴇病原的分離與鑒定實驗研究

尚麗元1劉 蕾2高雪霏3

(1.吉林莫莫格國家級自然保護區管理局，吉林白城 132000；2.吉林向海國家級自然保護區管理局，吉林通榆 137215；3.吉林莫莫格國家級自然保護區管理局，吉林白城 132000)

本文通過對丹頂鶴和大鴇的病例剖檢，病毒、細菌的分離和培養、染色鏡檢、生化鑒定和16SrRNAPCR測定，實驗檢測結果表明該死亡的丹頂鶴和大鴇因致病性大腸桿菌感染。經過藥敏試驗篩選得到了復方新諾明為最佳治療藥物，通過三天的飲水給藥，大群癥狀明顯得到控制。藥敏試驗結果表明人工養殖的丹頂鶴比半散養的大鴇體內分離的大腸桿菌耐藥普廣。

丹頂鶴；大鴇；病例剖檢；生化鑒定

1 試驗方法

剖檢死亡丹頂鶴，可聞到淡淡的特殊臭味，肺臟、小腸粘膜充血出血。死亡大鴇剖檢癥狀不明顯。疑似大腸桿菌。取丹頂鶴的脾臟和肝臟等組織，低溫研磨充分，制備成1：5組織懸液，離心后取上清液，加雙抗（青霉素、鏈霉素）用0.22μm的濾膜濾過，用注射器經尿囊腔接種9～10日齡的雞胚，放置于恒溫培養箱內孵化24h，照蛋挑出死亡的雞胚，收集死亡的雞胚放到4℃冰箱內保存。孵化至第4d，將全部未死亡的雞胚放到4℃冰箱冷藏4h，收集尿囊液，做血凝試驗（HA）。在無菌條件下，將丹頂鶴和大鴇的肝臟和心臟分別各劃線接種兩個加有犢牛血清的肉湯瓊脂培養基上。分別將兩組做好標記。第一組培養皿置于37℃恒溫培養箱內培養24h。第二組培養皿放置于厭氧罐里置于37℃恒溫培養箱內厭氧培養24h。分別挑取1～2個菌落接種到伊紅-美蘭培養基、麥康凱培養基、三糖鐵培養基上，放置于37℃培養箱內培養18～24h后觀察菌落的生長情況。涂片革蘭氏染色觀察，剖檢同時將丹頂鶴的心、肝和大鴇的心、肝，在無菌條件下將其新鮮切面在干凈的載玻片上壓印，自然干燥，火焰固定，革蘭氏染色。細菌純培養，用無菌牙簽在麥康凱培養基上挑取單一菌落，經革蘭氏染色后，油鏡下觀察細菌的形態和顏色。再挑去單一菌落在麥康凱瓊脂斜面上劃線，放入37℃恒溫培養箱中，培養12h后，獲得純培養物。然后再挑取純培養的單一菌落接種在LB液體培養基中，放于37℃恒溫搖床內培養12h。培養菌落的LB培養基和挑完菌的麥康凱瓊脂平板置于4℃冰箱內保存備用。分離菌株的16SrRNAPCR分子鑒定，在超凈臺內挑出單個菌落，接種于LB液體培養基內，放置于37℃搖床內培養18h，此菌液作為PCR菌液的模板。將15只昆明鼠隨機分成3組，每組5只，第3組為對照組。將從丹頂鶴體內分離后純培養的菌株經腹腔注射第一組小鼠；將從大鴇體內分離后純培養的菌株經腹腔注射第二組小鼠，每只小鼠腹腔注射純培養菌液0.1ml，對照組注射普通肉湯0.1ml，隔離詞養。每天觀察記錄小鼠的精神狀態，食欲和臨床癥狀和死亡情況，對死亡小鼠進行剖檢觀察，并取小鼠肝臟等進行細菌回歸試驗。按Kirby-Bauer氏法，使用21種藥敏紙片對從丹頂鶴和大鴇體內分離出的細菌進行藥敏試驗。

2 實驗結果

2.1 病毒分離結果

接種雞胚后，孵化到第4d，結果均無死亡，收集尿囊液，經血凝試驗，無血凝性。雞胚的尿囊液盲傳了三代，均沒有凝血性。排除了感染禽流感病毒和新城疫病毒的可能。電子顯微鏡下未見到病毒粒子。

2.2 細菌分離鑒定結果

經過不同培養基的分離和純化培養，在丹頂鶴體內和大鴇體內各分離一株細菌。兩株細菌在各培養基的生長情況相似。在血清肉湯培養基上呈現濕潤、光滑、灰白色，邊緣整齊的菌落，正常培養和厭氧培養下的的菌落，生長狀況均良好。在麥康凱培養基上呈桃紅色、濕潤、光滑、中間凸起、邊緣整齊直徑約1.5mm的菌落；在伊紅-美蘭瓊脂培養基上呈黑金屬光澤的圓形小菌落；三糖鐵瓊脂斜面培養基產酸產氣，斜面和底層均變黃，在液體的LB培養基中，呈均勻渾濁的，管底菌液有沉淀。形態學觀察結果，革蘭氏染色，鏡檢可見到革蘭氏陰性細菌，散在或成排、兩端鈍圓，兩極濃染，無芽孢的短小桿菌見。生理生化試驗結果，丹頂鶴源分離株可以利用麥芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、棉子糖和乳糖并產酸產氣，不利用山梨醇、鼠李糖和阿拉伯糖，丹頂鶴源分離株可以利用麥芽糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖、鼠李糖和乳糖并產酸產氣，不利用棉子糖和阿拉伯糖，兩株菌在山梨醇、棉子糖和鼠李糖的利用有差異。

3 藥敏試驗結果與耐藥性分析

丹頂鶴源和大鴇源分離出的兩株大腸桿菌有著明顯的藥敏差異，丹頂鶴源分離株對氯霉素、慶大霉素、復方新諾明、卡那霉素高敏，對多粘菌素、阿米卡星中度敏感，其余藥品均不同程度的耐藥包括頭孢類、青霉素類、喹諾酮類、四環素類；大鴇源的大腸桿菌除了對多粘菌素、利福平、鏈霉素、四環素耐藥外，對其他藥品都有較高的敏感性。試驗結果可以看出人工孵化的丹頂鶴體內分離出的致病性大腸桿菌的耐藥譜遠遠高于從半散養狀態下大鴇體內分離出的大腸桿菌的耐藥譜。丹頂鶴由人工孵化，出殼后一直由人工飼養，出現拉稀、食欲不振的情況下飼養員通常會給與一些預防用藥而半散養狀態下的大鴇不曾用藥。這可能是兩株菌的耐藥性差異的原因。

4 討論

本試驗中的丹頂鶴由人工繁育，食物基本是魚類，五月份天氣轉暖后，魚容易腐敗，雛鶴吃了不新鮮的魚易發生腹瀉，通常會給一定量的抗生素進行預防和治療。雛鶴的飼養環境常與游客和閑雜人接觸，也給疾病傳播創造了便利條件。而大鴇在圍網內很少接觸到外來人員，食物也多來自于環境中的昆蟲，所以體內的大腸桿菌的耐藥性要比丹頂鶴弱一些。避免疾病的發生最重要因素則是均衡的營養搭配，保證機體礦物質元素的需求，提高自身免疫力。籠養鶴的某些寄生蟲性疾病、細菌性疾病的發生與飼養環境有著很大的關系，如住白細胞原蟲病、球蟲病；大腸桿菌、巴氏桿菌性疾病都是由條件性致病菌引起的，這些疾病的發生與通風不良、飼養密度過大、排泄物清掃不及時、消毒不及時等因素有密切的關系。

[1] 陳浩，呂士成，李春榮，等.丹頂鶴疾病防治的給藥途徑與技術[J].中國家禽，2006，28（20）：34-35.