體外軟骨細胞凋亡模型及其介導的信號通路研究進展

周炎，劉世清

(武漢大學人民醫院骨科，湖北 武漢 430060)

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體外軟骨細胞凋亡模型及其介導的信號通路研究進展

周炎，劉世清*

(武漢大學人民醫院骨科，湖北 武漢 430060)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種累及關節軟骨、軟骨下骨質、關節囊及關節周圍韌帶、滑膜及肌肉的慢性、進展性骨關節疾病，以關節疼痛、腫脹、僵硬及活動受限為主要臨床表現。隨著人口老齡化日趨嚴重，OA發病率逐年增加，其所帶來的社會問題應引起重視。關節軟骨由軟骨細胞及軟骨基質組成，在正常的生理條件下，軟骨細胞具有調節軟骨基質合成及降解平衡的生理功能，進而保持關節軟骨結構及功能的完整性[1]。目前，國內外學者對OA病因及發病機制進行了大量的科學研究，雖至今仍未完全明確，但在一定程度上達成了共識。軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞類型，負責維護和改造細胞外基質結構及功能的完整性，維持軟骨內穩態[2]。越來越多的證據表明軟骨退變與軟骨細胞死亡密切相關，且軟骨細胞死亡以凋亡及壞死的形式存在，其中軟骨細胞凋亡在OA關節軟骨退變的病理學特征中尤為明顯，表現為軟骨細胞核染色體固縮、DNA碎裂、細胞皺縮、質膜囊泡及凋亡小體形成，同時伴有軟骨基質的降解和鈣化[3]。軟骨細胞凋亡比例與關節軟骨破壞及軟骨基質損耗程度具有高度一致性，確立了軟骨細胞凋亡機制在OA疾病發生、發展過程中的重要作用。本文就近年來體外軟骨細胞凋亡模型構建及其介導的信號通路研究進展綜述如下。

1 體外誘導軟骨細胞凋亡模型

1.1 硝普鈉 硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)是一種具有強烈的血管舒張作用的無機鹽類，以往臨床上多采取靜脈注射用于急性高血壓的緊急處理。同時，SNP作為一氧化氮(nitric oxide，NO)的供體，可以釋放外源性的NO，在OA及類風濕關節炎滑膜及軟骨組織中，由一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)誘導產生的NO含量可明顯升高，并伴有軟骨細胞凋亡、蛋白聚糖和膠原合成降低、基質金屬蛋白酶活性增高及關節軟骨炎癥表現[4]。目前，利用SNP誘導軟骨細胞凋亡被廣泛運用于OA疾病的基礎研究。Wu等[5]報道利用SNP誘導兔軟骨細胞凋亡，24h后檢測軟骨細胞核碎裂、固縮，通過流式檢測凋亡率明顯增高，線粒體膜電位降低，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3活性增強。Chen等[6]運用SNP刺激兔關節軟骨細胞后，通過掃描電鏡觀察軟骨細胞皺縮，呈圓形態，細胞溶解或分離，流式細胞檢測凋亡明顯增加，線粒體膜電位降低，檢測培養基上清液前列腺素E2表達水平升高。我們之前的研究亦運用SNP誘導大鼠軟骨細胞凋亡，軟骨細胞活力明顯降低，可誘導軟骨細胞進行骨架改建，iNOS及caspase-3蛋白表達升高，是較為理想的軟骨細胞凋亡誘導劑[7]。同時需注意，SNP溶液相對不穩定，儲存時間過長或見光容易分解，影響藥物活性，遂建議避光保存，并盡可能新鮮配置使用。

1.2 白介素(interleukin，IL)-1β IL-1β作為關節軟骨退變過程中最直接的促炎細胞因子，可促進前列腺素E的合成，刺激NO、過氧化物及過氧亞硝基等多種活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，進而促進基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)高表達，抑制組織金屬蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的合成，誘導軟骨細胞凋亡，常作為構建體外及體內OA模型的誘導劑[8]。Zheng等[9]報道應用IL-1β(10 ng/mL)體外誘導大鼠軟骨細胞凋亡，24 h后檢測細胞活力明顯降低，且胞核固縮及裂解現象明顯，蛋白印跡檢測軟骨細胞MMP-13含量升高，同時TIMP-1、Bcl-2及Bcl-xl含量降低。Kimura等[10]運用IL-1β體外可刺激牛科鼻部軟骨中蛋白多糖和膠原蛋白的釋放，促進關節軟骨細胞MMP-13的產生，同時IL-1β可促進軟骨細胞NO的表達，誘導軟骨細胞凋亡病理改變。Ju等[11]報道利用IL-1β刺激兔關節軟骨細胞后出現DNA碎裂，軟骨細胞凋亡比例明顯升高，同時caspase-3活性增強。

1.3 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α TNF-α是OA關節軟骨退變發生過程中重要的介質，可促進關節滑膜及軟骨細胞中細胞因子及趨化因子的表達，誘導軟骨細胞產生MMPs，使得軟骨中Ⅱ型膠原及蛋白聚糖含量降低[12]。多項研究證實TNF-α可促進軟骨細胞凋亡，并與caspase家族成員密切相關。Guo等[13]運用酶免疫分析法測量外科手術構建OA模型兔血清中TNF-α含量，結果顯示TNF-α含量較正常對照組明顯增高，同時軟骨組織中caspase-3及caspase-8表達與TNF-α含量呈現正相關系。Guo等[14]報道分別運用IL-1β(10 ng/mL)及TNF-α(5 ng/mL)刺激人關節軟骨細胞，可提高內質網(endoplasmic reticulum，ER)未折疊蛋白反應，促進ER應激介導的凋亡途徑，導致軟骨細胞凋亡，且該反應與ER應激誘導劑引起的效能相當。Lee等[15]報道體外運用TNF-α聯合環己酰亞胺誘導大鼠軟骨細胞死亡，包括細胞凋亡、自噬性細胞死亡及壞死性凋亡三種形式，環己酰亞胺作為細胞轉化抑制劑可以激活軟骨細胞，結果表明在兩種誘導劑同時作用時，軟骨細胞活力明顯降低，單獨TNF-α或環己酰亞胺均不能導致細胞活力降低，同時可以刺激細胞色素c從線粒體釋放到胞質，并通過流式細胞檢測凋亡率明顯增加，且細胞核固縮、碎裂表現明顯，軟骨細胞中caspase-3和caspase-7表達增高。

1.4 Fas抗體 Fas也稱CD95，屬于腫瘤壞死因子受體和神經生長因子受體超家族，是一種與細胞凋亡密切相關的跨膜蛋白分子。相關研究表明，OA關節軟骨中Fas表達較正常軟骨明顯升高，且Fas表達集中在軟骨病變區域內，Fas抗體與細胞表面Fas結合后可誘導軟骨細胞凋亡，并激活相關凋亡信號通路[16]。Ryu等[17]運用CD95抗體刺激小鼠軟骨細胞凋亡呈現濃度依賴性，高濃度(0.5或1mg/mL)CD95抗體方可誘導軟骨細胞凋亡，且缺氧誘導因子可加劇CD95抗體誘導軟骨細胞凋亡的能力。

1.5 地塞米松 Tu等[18]利用地塞米松(25 μg/mL)刺激人軟骨細胞凋亡，24 h后顯示軟骨細胞活性及增殖能力降低，流式細胞檢查凋亡軟骨細胞明顯增多，且Fas調節的死亡信號通路是地塞米松誘導軟骨細胞凋亡中重要的途徑，實時熒光定量核酸擴增及細胞免疫熒光檢測顯示caspase-3及Fas含量明顯升高。

1.6 前列腺素(prostaglandin，PG)E2PGE2是骨及軟骨組織中維持細胞功能的重要調節因素，同時在正常關節軟骨新陳代謝及OA疾病的發病機理中發揮重要的作用。相關研究表明，PGE2是關節生長板軟骨細胞中DNA合成及硫酸鹽滲入最有效的細胞因子，在OA關節滑膜組織中檢測PGE2表達明顯增高，可誘導軟骨細胞凋亡改變[19]。Miwa等[20]報道利用PGE2體外刺激?？栖浌羌毎Y果顯示PGE2抑制軟骨細胞活力，促使細胞DNA碎裂，進一步證實PGE2誘導凋亡機制并不是通過NO途徑產生，而是通過激活軟骨細胞環腺苷酸，從而提高細胞內的環腺苷酸水平來誘導軟骨細胞凋亡。

1.7 雙氧水(H2O2) 由于能誘導軟骨細胞產生ROS，改變線粒體膜通透性，使細胞色素c從線粒體釋放到胞質，H2O2常被用作軟骨細胞凋亡的誘導劑。Na等[21]報道運用H2O2(500 μM/L)誘導鼠軟骨細胞凋亡，出現軟骨細胞活力降低，線粒體膜電位下降，軟骨細胞蛋白Bcl-xL/Bax比例降低，caspase-3活性增加等軟骨細胞凋亡表現。

1.8 重組腺病毒載體(recombinant adenovirus vectors，RAAV) RAAV是TNF家族中一種Ⅱ型跨膜蛋白，OA關節軟骨中RAAV表達與軟骨細胞凋亡比例及軟骨退變程度相關。Lee等[22]首次報道運用RAAV體外刺激軟骨細胞凋亡，檢測軟骨細胞活力及線粒體膜電位降低，使線粒體中細胞色素c釋放，細胞核固縮及DNA碎裂，并激活DNA聚合酶活性，刺激caspase-3和Bax高表達及Bcl-2低表達，證實RAAV體外具有誘導軟骨細胞凋亡的作用。

1.9 堿性磷酸鈣晶體 堿性磷酸鈣晶體由磷酸八鈣、磷酸三鈣、碳酸磷灰石及羥磷灰石組成。在重度OA關節軟骨中發現堿性磷酸鈣晶體在基質小囊中沉積，且與OA病情嚴重程度密切相關，堿性磷酸鈣晶體可隨著軟骨退變或原位合成過程從軟骨下骨中釋放出來[23]。Ea等[24]報道運用堿性磷酸鈣晶體體外誘導?？栖浌羌毎蛲觯撨^程與IL-1β、TNF-α及NO途徑完全獨立，需要與軟骨細胞接觸后形成內吞及溶酶體內晶體降解作用，且膜聯蛋白-5過表達可以明顯加劇堿性磷酸鈣晶體促凋亡效能。

1.10 多氯聯苯 多氯聯苯為持久性有機污染物，廣泛分布在室外空氣、海水及河道的沉積物中，并在許多不同水平的食物鏈中被發現，其化學特性及毒性作用與其結構特性密切相關。相關研究表明多氯聯苯可刺激關節軟骨IL-6及TNF-α分泌，誘導軟骨細胞凋亡及關節軟骨退變，與OA疾病的發生、發展關系密切[25]。Abella等[26]報道運用多氯聯苯體外誘導軟骨細胞凋亡，結果顯示軟骨細胞活力明顯降低，caspase-3蛋白表達增高及Bcl-2/Bax蛋白比例降低，通過脂質過氧化作用檢測軟骨細胞抗氧化能力降低，產生氧化應激反應，引起線粒體DNA損傷。Lee等[27]利用多氯聯苯體外刺激兔關節軟骨細胞，顯示細胞活力隨時間及劑量關系呈現不同程度的降低，檢測細胞caspase-3表達升高，TUNEL染色及ELISA檢測DNA碎裂顯示凋亡比例明顯增加，多氯聯苯通過促進軟骨細胞ROS及NO產生，誘導軟骨細胞凋亡，加劇關節軟骨退變。

1.11 晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs) AGEs是促進關節軟骨退變及軟骨細胞凋亡的重要遞質，可與關節軟骨膠原分子直接交聯，導致關節僵硬及組織脆性增加，其在關節軟骨中的異常表達被視為與年齡相關性最為密切的變化[28]。Yang等[29]報道體外運用AGEs(200 μg/mL)誘導兔軟骨細胞凋亡，發現AGEs通過上調軟骨細胞ROS，促進細胞色素c從線粒體釋放到胞質，激活caspase-3活性，降低線粒體膜電位及抑制三磷酸腺苷產生，促進凋亡改變，可用于體外軟骨細胞凋亡模型的構建。

1.12 阿霉素及衣霉素 阿霉素作為軟骨細胞凋亡的誘導劑，主要通過激活caspase的活性，促進DNA碎裂引起，衣霉素則被視為ER激動劑誘導軟骨細胞凋亡。Kumagai等[30]報道運用阿霉素體外刺激兔軟骨細胞，其最顯著的特征是可在數分鐘內減少軟骨細胞的橫截面積，刺激凋亡軟骨細胞體積減小，并伴有caspase-3及caspase-7活性增強，誘導軟骨細胞凋亡。Lin等[31]運用衣霉素(2 μg/mL)誘導鼠軟骨細胞凋亡，可降低細胞活力及線粒體膜電位，caspase-3、caspase-9、Bax蛋白及mRNA表達增加，衣霉素通過調節ER誘導軟骨細胞凋亡。

2 軟骨細胞凋亡介導的信號通路

2.1 胞內磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase，PI3K-Akt)信號通路 Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以被細胞外因子以PI3K依賴的方式磷酸化或激活。PI3K-Akt是一條經典的抗軟骨細胞凋亡通路，當細胞外信號刺激PI3K-Akt發生磷酸化后，可促進軟骨細胞中凋亡因子Bcl-2釋放，抑制Bax活性，并有利于蛋白聚糖合成及軟骨細胞成活，達到抗凋亡效能。因此，PI3K-Akt信號通路可有效地抑制由線粒體途徑誘導的軟骨細胞凋亡。Wang等[32]報道紫草素通過激活PI3K-Akt信號通路，降低caspase-3活性，抑制細胞色素c釋放，達到抗IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡效果。Huang等[33]報道人參皂苷抗凋亡作用是通過活化PI3K-Akt信號通路，抑制軟骨細胞caspase-3釋放完成。Zheng等[9]報道通過激活PI3K-Akt信號通路，煙堿可中和由IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡作用。

2.2 P38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路 P38 MAPK屬于應力激酶家族成員，易被促炎細胞因子及滲透性改變、營養缺失、機械性負荷增加、低氧張力等環境因素激活。同時激活的P38可使轉錄因子磷酸化，從而轉導信號進入原子核，改變基因表達。NO、IL-1β及TNF-α可誘導軟骨細胞中P38 MAPK磷酸化，參與調節軟骨細胞表型及增殖，促進軟骨細胞肥大、鈣化、骨架重塑及凋亡改變，刺激軟骨細胞MMPs合成及炎性細胞因子產生，介導軟骨細胞凋亡信號途徑。Sakata等[34]報道通過抑制NO誘導的軟骨細胞P38 MAPK磷酸化，下調MMP-3、MMP-13及caspase-3表達，十二碳五烯酸可抑制軟骨細胞凋亡。Wei等[16]報道抑制P38 MAPK活化可作為OA潛在的治療靶點，達到保持關節軟骨細胞功能結構，抑制軟骨細胞凋亡及促進增殖效能。

2.3 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路 JNK是分子量為54 kD、位于細胞質中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱為應激活化蛋白激酶(Stress-activated kinases，SAPK)，是MAPK家族中重要成員之一。JNK信號通路可被細胞應激反應(如電離輻射、熱休克及氧化損傷)、細胞因子(如NO、TNF-α、TGF-β及IL-1β)及生長因子(如表皮生長因子)激活而形成磷酸化JNK，參與細胞分化與增殖，維持細胞形態及骨架構建，并可直接激活胞質內靶蛋白(如Bax及Bim)，從而介導由線粒體途徑引起的細胞凋亡。Sylvester等[35]研究表明IL-1通過激活JNK信號通路，一方面可上調MMP-13在關節軟骨細胞中表達，導致關節退變及軟骨細胞凋亡發生，另一方面可活化轉錄活化因子-2，促進環氧合酶(cyclooxygenase，COX)-2基因的轉錄，誘導軟骨細胞炎癥及凋亡。Lee等[15]報道JNK信號通路參與了TNF-α介導的軟骨細胞凋亡，通過上調軟骨細胞caspase-3及caspase-7活性，使磷酸化JNK表達增高，該過程可被JNK抑制劑逆轉。

2.4 核因子(nuclear factor，NF)-κB信號通路 NF-κB是一類廣泛存在于機體細胞中的多顯性核轉錄因子，廣泛參與調節細胞增殖與分化、細胞周期及細胞凋亡等過程，是Rel基因家族重要成員。在靜息狀態下，無活性的NF-κB以潛在狀態分布于細胞漿中，它與抑制因子結合成為異源多聚體P50-P60-IκBα(IκBβ)。當細胞受到細胞因子等因素刺激時，IκBα從三聚體中游離出來，P50亞基上的易位信號及P56亞基上DNA結合位點被充分暴露，使異二聚物顯示出NF-κB活性，并易位入細胞核，激活Bcl-2及p53等靶基因，參與構成細胞凋亡機制[36]。Qin等[37]報道IL-1β體外誘導的軟骨細胞凋亡模型中，NF-κB被激活后可刺激軟骨細胞中TNF-α、iNOS及COX-2產生，參與調節軟骨細胞炎癥及凋亡過程。Lee等[27]報道多氯聯苯可通過刺激軟骨細胞ROS及NO產生，激活NF-κB過程，從而誘導軟骨細胞凋亡。

2.5 酪氨酸激酶/信號轉導子和轉錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路 與眾多細胞因子及生長因子信號轉導有關的JAK/STAT通路，密切參與了細胞炎癥、氧化應激、細胞增殖、分化及凋亡等病理過程。JAK/STAT信號轉導過程概括為：細胞膜上的細胞因子受體在細胞膜上與相應配體結合后，誘導受體二聚化并調節與之偶聯的JAKs，在胞質內的JAKs及其受體酪氨酸殘基上依次發生交互磷酸化，并與周圍氨基酸序列結合形成“停泊位點”，STATs通過SH2結構域將STAT蛋白補位到該特異位點，從而激活STAT?；罨蟮腟TAT與受體解離，形成同源二聚體或異源二聚體轉位入細胞核，與DNA上特定靶序列結合，調控基因的轉錄及誘導表達[38]。Greene等[39]報道IL-1β聯合抑瘤素作用于人關節軟骨細胞，其誘導凋亡途徑是通過激活JAK/STAT信號通路完成，并刺激軟骨細胞MMP-13高表達。Lim等[40]利用IL-1β通過激活JAK/STAT信號通路誘導軟骨細胞凋亡及MMP-13表達增高，該過程可被類黃酮藥物作用逆轉。

綜上所述，多種細胞因子及信號轉導通路共同參與軟骨細胞凋亡的復雜病理過程，且各種細胞信號轉導途徑縱橫交錯、相互影響，構成了一個復雜的細胞凋亡信號轉導通路網絡，介導軟骨細胞損傷及凋亡病變。眾多的軟骨細胞凋亡誘導因子通過信號轉導通路傳遞刺激信號至效應細胞，誘導靶基因轉錄增加，導致軟骨細胞凋亡及壞死發生，密切參與OA發生、發展過程。研究軟骨細胞凋亡信號傳導通路有助于更深入地探討關節軟骨發生退行性病變的分子機制，為OA防治研究提供了良好的思路及途徑。

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1008-5572(2016)11-1010-05

R684.3

A

2016-03-15

周炎(1984- )，男，主治醫師，武漢大學人民醫院骨科，430060。

*本文通訊作者：劉世清