Lgr5、β—catenin蛋白在結直腸癌中的表達及意義

鄭茗貞　陳會　劉魯英

【摘 要】采用免疫組織化學染色法檢測138例結直腸癌、19例結腸腺瘤和11例正常結腸黏膜組織中Lgr5蛋白的表達情況，并分析結直腸癌組織中Lgr5蛋白表達與β-catenin蛋白表達的相關關系。結果，Lgr5蛋白表達在正常結腸黏膜、結腸腺瘤與結直腸癌組織中逐漸升高在，發生淋巴結轉移、TNM分期高的腫瘤組織中，Lgr5蛋白表達顯著升高，并與β-catenin的表達顯著相關。Lgr5的異常表達與大腸癌發生、發展密切相關。

【關鍵詞】結直腸癌；Lgr5；β-catenin；免疫組織化學染色

【Abstract】Our study focused on expression of Lgr5 and β-catenin in normal colorectal mucosa， adenoma and colorectal cancer. Immunohistochemistry data showed that Lgr5 expression was obviously increased in adenoma and CRC tissues. The expression of Lgr5 in CRC tissue was obviously associated with lymph node metastasis， TNM staging of CRC and β-catenin expression. Lgr5 might play a key role in the genesis and development of CRC.

【Key words】Colorectal cancer； Lgr5； β-catenin； Immunohistochemistry

結直腸癌（Colorectal carcinoma，CRC）的發病率和死亡率有逐漸升高的趨勢[1]。富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5（Leucine-rich

repeat containing G-protein-coupled receptor 5，Lgr5）是近年來研究發現的結直腸癌干細胞標志物之一，與大腸癌的發生及患者的預后密切相關[2-5]。Wnt信號通路的異常激活與多種腫瘤發生發展密切相關，β-連環蛋白（β-catenin）是經典Wnt信號系統的核心分子。有研究發現[4]，Lgr5是Wnt信號通路的靶基因，本研究采用免疫組織化學方法檢測Lgr5、β-catenin蛋白在結直腸正常黏膜、腺瘤和癌組織中的表達，探討Lgr5在結直腸癌發生發展中的作用機制及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集我院病理科2002-2007年存檔的結直腸癌根治術后標本蠟塊138例。其中男性76例，女性62例，平均年齡62.9歲（30歲～82歲）。所有患者術前均未接受放療、化療。結直腸癌分期根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）/國際抗癌聯盟（UICC）結直腸癌TNM分期系統，其中I期患者4例、II期50例、III期82例、IV期2例。選取2007年活檢存檔的正常結腸黏膜11例，腺瘤19例。所有標本均經10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm切片備用。

1.2 試劑

Lgr5兔抗人單克隆抗體（克隆號ab75732，1：400稀釋）購自Lifespan Biosciences公司，β-catenin鼠抗人單克隆抗體（克隆號CAT-5H10，1：200稀釋）購自美國Zymed Laboratories公司，EnVision免疫染色試劑盒購自Dako公司。

1.3 方法

免疫組織化學染色采用EnVision兩步法，操作步驟按照劑盒使用說明。4μm石蠟切片經過二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。抗原修復后，加一抗，4℃過夜，采用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，DAB顯色。常規設陰性對照和陽性對照。

1.4 結果判定標準

Lgr5蛋白定位于細胞膜和細胞質；β-catenin蛋白以定位于細胞核伴或不伴細胞質染色為陽性，單純細胞膜著色定義為陰性。免疫組化結果根據染色強度和染色陽性細胞的比例進行評價。染色強度分為4個等級：0（無著色）、1（淡黃色）、2（黃色）和3（棕黃色）；陽性細胞比例分為4個等級：0（<5%）、1（6%-25%）、2（26%-50%）、3（51%-75%）和4（>76%）。最終評分結果通過染色強度評分乘以陽性細胞比例獲得，最終計分9-12分記為+++（強陽性），5-8分記為++（中等強度陽性），1-4分記為+（弱陽性），0分記為-（陰性）。

1.5 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件包進行統計學處理。樣本率之間比較采用χ2檢驗和Fisher，s 精確檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析進行。以P值小于0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 Lgr5蛋白在大腸黏膜、腺瘤和結直腸癌組織中的表達

Lgr5在正常結腸黏膜、結腸腺瘤和癌組織中的表達率分別為9.09%（1/11）、36.84%（7/19）、58%（80/138）（表1）。Lgr5在正常結腸黏膜、結腸腺瘤和癌組織中的表達具有顯著性差異（P<0.05，圖1）。

2.2 β-catenin蛋白在大腸黏膜、腺瘤和結直腸癌組織中的表達

β-catenin在正常結腸黏膜、結腸腺瘤和癌組織中的表達率分別為27.27%（3/11）、57.89%（11/19）和75.4%（104/138），β-catenin在不同組之間表達的差異具有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3 Lgr5在結直腸癌組織中表達的臨床意義及其與β-catenin表達的相關性

在發生淋巴結轉移的患者癌組織中Lgr5蛋白表達顯著高于未發生淋巴結轉移的患者（P<0.05），Lgr5蛋白表達與結直腸癌TNM分期呈正相關（P<0.05），與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度無顯著相關性（P>0.05）（表2）。Lgr5與β-catenin蛋白在結直腸癌組織中的表達呈正相關（P<0.05）（表3）。

3 討論

Lgr5全稱為富含亮氨酸重復序列G-蛋白偶聯受體5，研究證實其在多種腫瘤組織中過度表達，包括肝癌、卵巢癌、食管癌等，并被證實是小腸、結腸以及毛囊干細胞的標志物[6]。本實驗采用免疫組織化學染色技術檢測了正常大腸黏膜、結腸腺瘤及結直腸癌組織中Lgr5蛋白的表達，發現其陽性表達率逐漸升高，說明Lgr5蛋白表達的異常升高可能是大腸癌發生過程中的早期事件。本研究證實在發生淋巴結轉移、TNM分期高的腫瘤組織中，Lgr5蛋白表達顯著升高，這與郝艷萍[7]、柴寧莉等[8]的研究結果一致。

Wnt/β-catenin信號通路被稱為經典Wnt信號通路，在早期胚胎發育、成體組織穩態維持、干細胞自我更新調控、細胞分裂以及腫瘤發生等過程中均發揮重要作用[9]。Wnt/β-catenin信號途徑的異常激活，導致其下游靶基因的表達增強，從而促進細胞異常增生。本研究表明Lgr5蛋白表達與β-catenin蛋白表達顯著相關，說明結直腸癌中，Wnt信號通路的異常激活，促進了靶基因Lgr5的表達，與結直腸癌的發生發展密切相關。本研究結果為今后研究結直腸癌發生發展的機制，發現分子診斷標記物提供了新的線索。

【參考文獻】

[1]Siegel R，Naishadham D，Jemal A. Cancer statistics[J].C A Cancer J Clin.， 2012， 62（l）：10-29.

[2]Carmon KS， Lin Q， Gong X， et al. R-spondins function as ligands of the orphan receptors LGR4 and LGR5 to regulate Wnt/beta-catenin signaling[J].Proc Natl Acad SciUSA，2011，108： 11452-11457.

[3]McClanahan T， Kochin S， Smith K， et a1. Identification of overexpression of orphan Gprotein-coupled receptor GPR49 in human colon and ovarian primary tumors[J].Cancer Biol Ther， 2006，5（4）：419-426.

[4]Clevers H，Schuijers J. Adult mammalian stem cells： The role of Wnt， Lgr5 and R-spondins[J].EMBO J， 2012，31：2685-2696.

[5]Valladares-Ayerbes M， Reboredo M， Blanco-Calvo M， et al. Evaluation of the adenocarcinoma-associated gene AGR2 and the intestinal stem cell marker LGR5 as biomarkers in colorectal cancer[J].Int J Mol Sci， 2012，13（4）：4367-4387.

[6]Barker N，van Es JH，Jaks V， et al. Very long-tern self-renewal of small intestine， colon， and hair follicles from cycling Lgr5+ve stem cells[Z]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol， 2008， 73：351-356.

[7]郝艷萍，胡順明，張世棟，等.干細胞標記物LGR5在結直腸癌發生發展中的表達及意義[J].山東大學學報，2009，47（8）：85-88.

[8]柴寧莉，張文成，王艷敏，等.Lgr5 和 CD44 在腸息肉和結直腸癌中的表達及意義[J].J South Med Univ.， 2013，33（7）：972-976.

[9]Clevers H， Nusse R. Wnt/beta-catenin signaling and disease[J].Cell， 2012，149： 1192-1205.

[責任編輯：王楠]