CYP2C8代謝紫杉醇產物6α—羥基紫杉醇的LC—MS/MS檢測

黃潔瓊

【摘 要】本文以紫杉醇為底物，建立其CYP2C8代謝產物6α-羥基紫杉醇的LC-MS/MS方法，為CYP2C8酶活性的研究提供可靠、靈敏、快速的檢測分析方法。采用電噴霧離子源（ESI），三級四級桿串聯質譜，多級反應監測進行定量，正離子掃描，選取離子對為6α-羥基紫杉醇892.3→308.1；內標多西紫杉醇830.3→549.4。利用Agela Venusil XBP C18 色譜柱（50×2.1mm；5μm）實現代謝物分離，柱溫40℃，流速為0.3mL/min，流動相為A相（水∶乙腈=95∶5）與B相（水∶乙腈=5∶95）梯度混合。代謝物6α-羥基紫杉醇與內標實現基線分離，峰形良好，而且不存在代謝與內標之間的干擾，且6α-羥基紫杉醇在5-500ng/ml的范圍為線性關系良好；該方法快速靈敏可用于CYP2C8活性檢測。

【關鍵詞】紫杉醇；CYP2C8；LC-MS

細胞色素P450酶（CYP450）是存在于細胞內質網上的蛋白質超家族，它對多種內源性、外源性物質在體內的氧化反應起著重要的作用，是藥物動力學和反應的變化的一個主要原因。在推定的57個有功能的人類細胞色素P450中，只有屬于CYP1、CYP2、CYP3這三個家族的大約十幾個酶對藥物的代謝起主要作用，其中包括CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5等[1]。其中，CYP2C8是CYP2C家族中最晚發現的一個成員，大約占CYP2C家族的26%。CYP2C8主要分布在肝臟，占肝CYP代謝酶總量的7%；其在肝臟外的組織中也存在少量的分布[2]。CYP2C8參與催化大約5%的臨床藥物，并且存在著明顯的基因多態性，對藥物的代謝清除有著明顯的影響。

紫杉醇是一種抗微管細胞藥物，被廣泛應用于治療卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、頭頸部癌等惡性腫瘤[3]。紫杉醇在人體內能夠被CYP3A4和CYP2C8代謝，分別生成p-3-羥基紫杉醇和6α-羥基紫杉醇[4-5]。在人肝微粒體中，6α-羥基紫杉醇的生成量高于p-3-羥基紫杉醇，這表明CYP2C8在紫杉醇體內代謝過程中發揮著重要作用[6]。為了研究CYP2C8酶活性則必須要建立快速、可靠、靈敏的檢測酶活性方法。本文以紫杉醇為底物，建立其CYP2C8代謝產物6α-羥基紫杉醇的LC-MS/MS方法，為CYP2C8酶活性的研究提供可靠，靈敏，快速的檢測分析方法。

1 試劑和儀器

1.1 試劑

甲醇（Merck，德國）；乙腈（Merck，德國）；紫杉醇及其代謝物6α-羥基紫杉醇（BD，美國）；多西紫杉醇（sigma，美國）。

1.2 儀器

液相色譜系統為日本Shimadzu液相色譜系統，包括LC-20AD輸液泵，SIL-20A自動進樣器以及Shimadzu CTO-20A柱溫箱；質譜系統為美國Applied Biosystems公司API 4000 Q TRAP三重四級桿串聯質譜儀，配備電噴霧電離源（Turbo Ionspray）以及Analyst 1.4.2數據采集軟件。

2 底物代謝物LC-MS/MS方法的構建

（1）用甲醇或乙腈將紫杉醇及其代謝產物6α-羥基紫杉醇稀釋至約1000ng/mL；

（2）激活Mass only，修改參數，以10μL/min進入質譜儀；

（3）記錄相應參數：底物及代謝產物的母離子Q1、子離子Q3、去溶劑電壓DP，撞擊能量CE；

（4）激活LC/MS，修改參數。選擇合適流動相，分別用甲醇或乙腈配制低高兩個濃度的代謝產物單樣及低、高兩個濃度的代謝產物和內標的混合液進樣，調整相應參數使得底物，代謝產物及內標實現基線分離并使其系列濃度擁有良好的線性；

（5）清洗管路。

3 結果

通過液相串聯質譜對紫杉醇的代謝產物6α-羥基紫杉醇建立專屬靈敏的LC-MS/MS方法，進行定量檢測。采用正離子模式，選擇離子對m/z 892.4→324.1（圖1）和m/z 830.3→549.4（圖2）分別測定6α-羥基紫杉醇和多西紫杉醇（內標）的含量；色譜圖如圖3所示，方法總結見表1。代謝物與內標實現基線分離，峰形良好，而且不存在代謝與內標之間的干擾，6α-羥基紫杉醇在5-500ng/ml的范圍為線性關系良好。該方法快速靈敏可用于CYP2C8活性檢測。

4 結論

本文選取紫杉醇為CYP2C8代謝酶的探針底物，并建立了其主要代謝物6α-羥基紫杉醇的LC-MS方法，代謝物與內標峰形良好，分離度好，且不存在相互干擾，可為評價CYP2C8代謝酶的活性提供靈敏、快速、特征專屬的檢測方法。

【參考文獻】

[1]謝章明.人CYP3A4與POR及cytb_5共表達條件的優化以及表達產物在藥物相互作用研究中的應用[D].浙江大學，2013.

[2]Klose TS， Blaisdell JA， Goldstein JA. Gene structure of CYP2C8 and extrahepatic distribution of the human CYP2Cs[J]. Journal of Biochemical & Molecular Toxicology， 1999，13（6）：289-295.

[3]郭培鳳，郭云利.紫杉醇應用相關不良反應觀察[J].醫學信息，2014（2）：643.

[4]Monsarrat B， Mariel E， Cros S， et al. Taxol metabolism. Isolation and identification of three major metabolites of taxol in rat bile[J]. Drug Metabolism & Disposition， 1990， 18（6）：895-901.

[5]Walle T， Kumar GN， McMillan JM， et al. Taxol metabolism in rat hepatocytes[J]. Biochemcal Pharmacology， 1993，46（9）：1661-1664.

[6]Taniguchi R， Kumai T， Matsumoto N， et al. Utilization of human liver microsomes to explain individual differences in paclitaxel metabolism by CYP2C8 and CYP3A4[J]. Journal of Pharmacological Sciences， 2005，97（1）：83-90.

[責任編輯：王楠]