栝樓薤白半夏湯對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌自噬及凋亡的影響*

唐丹麗，劉寨華，崔海峰，周艷華，隋 宇，張華敏

(1．中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700;2．中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700;3．中國中醫科學院中醫藥信息研究所，北京 100700)

栝樓薤白半夏湯對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌自噬及凋亡的影響*

唐丹麗1，劉寨華2，崔海峰1，周艷華1，隋 宇1，張華敏3△

(1．中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700;2．中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700;3．中國中醫科學院中醫藥信息研究所，北京 100700)

目的:觀察栝樓薤白半夏湯對心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)大鼠心肌自噬及凋亡的影響。方法:將40只SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、3-MA干預組及栝樓薤白半夏湯組，采用可逆性冠脈左前降支結扎缺血30 min、再灌注2 h復制MI/RI模型。利用全自動生化儀檢測血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量，采用Western blot法測定心肌自噬基因Beclin-1、LC3II及促凋亡蛋白Bax表達水平。結果:與假手術組比較，模型組大鼠血清CK、LDH含量與心肌Beclin-1、LC3 II、Bax蛋白表達及LC3 II/LC3I水平均顯著升高，與模型組比較，栝樓薤白半夏湯組及3-MA干預組能降低血清CK、LDH含量，下調心肌Beclin-1、LC3 II、Bax蛋白表達及LC3 II/LC3I水平，且栝樓薤白半夏湯抑制Beclin-1表達作用優于3-MA干預組。結論:心肌缺血再灌注可引起自噬反應增強，促進凋亡損傷，栝樓薤白半夏湯通過抑制自噬、改善心肌細胞凋亡而起到心肌保護作用。

心肌缺血再灌注損傷;自噬;凋亡;栝樓薤白半夏湯

自噬(autophagy)是廣泛存在于真核細胞生物中的一種細胞自我吞噬現象，在正常生理狀態下，自噬能夠清除衰老的細胞器及降解異常積聚的蛋白質，從而保持機體內環境的穩定;當缺氧或營養物質缺乏時，自噬可通過降解胞內物質產生氨基酸和脂肪酸為機體提供能量，并促進機體蛋白和細胞器的合成。諸多證據顯示［1-2］，自噬參與心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)過程，并在MI/RI病理進程中扮演重要角色。

中醫藥對MI/RI保護作用的研究是近年來中西醫結合研究的切入點之一，如何在治療該病的有效治法方藥中系統地進行篩選并研究其作用機制，對發掘傳統中藥方劑的臨床實用價值、闡明中藥科學內涵有積極的推動作用。栝樓薤白半夏湯出自東漢醫家張仲景所著《金匱要略》，是治療胸痹的名方，具備通陽散結、祛痰寬胸之功效，是臨床常用于治療心血管疾病的有效方劑。課題組前期研究顯示［3］，該方具有抑制再灌注后 NF-кB信號通路活化、減輕炎癥損傷的作用。本研究旨在明確其對MI/RI過程中心肌自噬及凋亡的影響，以期進一步闡明該方對再灌注損傷心肌的保護作用。

1 材料

1.1 動物

雄性SD大鼠40只，體質量(250±20)g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供(許可證號SCXK-(軍)2012-0004)。

1.2 藥物

栝樓薤白半夏湯組成:栝樓24 g，薤白9 g，半夏12 g，白酒24 L［4］，所有藥材由北京同仁堂(亳州)飲片有限責任公司提供。藥物劑量換算依70 kg成人每日1劑原方用量，換算出大鼠每日用量，濃縮成含生藥1.3 g/ml的水煎液。

1.3 主要試劑與儀器

CK、LDH試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司;自噬抑制劑、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)Sigma公司產品;Bax抗體，Cell Signaling Technology公司產品;辣根過氧化物酶標記二抗，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司產品。動物呼吸機ALC-V8，上海奧爾科特公司;多道生理信號采集處理系統，成都儀器廠;全自動生化分析儀，日本HITACHI公司;Power Pac Basic電泳儀，美國Bio-Rad公司;MK3酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

2 方法

2.1 動物模型復制

大鼠術前12 h禁食不禁水，腹腔注射20%烏拉坦(0.5 m1/100 g)，麻醉后仰臥位固定四肢及頭部，記錄Ⅱ導心電圖。頸部、胸前手術野備皮，切開氣管連接動物呼吸機(呼吸頻率70次/min，吸呼比1∶2，潮氣量9 ml/kg)。自左側第3～4肋間剪開皮膚，鈍性分離肌肉組織，打開胸腔剪開心包膜，于左心耳與肺動脈圓錐之間找出冠狀動脈左前降支，并以5-0號絲線結扎分支起點外約1～2 mm(在絲線與心肌間放一根聚乙烯小管)，此時缺血心肌壁呈現發紺、膨出，同時記錄心電圖，以標準肢導聯Ⅱ導聯ST段弓背上抬，T波高聳，顯示心肌缺血形成。再灌注模型結扎30 min后松開，使缺血冠脈再灌注，關閉胸腔再灌注120 min，心電圖示ST段回落1/2以上，提示造模成功。結扎前心電圖不正常或未到觀察終點而死亡以及造模不成功者剔除。假手術組在開胸后不結扎冠脈，而僅在相應部位用針空穿1次即可。3-MA干預組于再灌注前10 min尾靜脈注射給藥(20 mg/kg)。

2.2 動物分組及給藥

按隨機數字表法將40只大鼠分為假手術組、模型組、3-MA干預組及栝樓薤白半夏方組。各組動物常規飼養，條件相同。栝樓薤白半夏方組灌服中藥煎液1 ml/(100 g·d)，其余各組大鼠每日灌服生理鹽水1 ml/(100 g·d)，造模前連續給藥3周。在實驗過程中各組均有死亡，每組隨機取8只備檢，最終32只大鼠納入統計。

2.3 指標檢測

2.3.1 標本采集 大鼠再灌注2 h后腹主動脈取血，之后迅速剪取心臟，預冷生理鹽水沖洗，冰盤上切取部分左冠狀動脈供血區的心肌組織，稱重后即于液氮中迅速冰凍，置于－80℃保存備用。

2.3.2 血清心肌酶學檢測 取血后離心3000 r/15 min分離血清，按試劑盒說明書，利用全自動生化分析儀進行心肌酶指標檢測。

2.3.3 Western blot法檢測心肌 Beclin-1、LC3II及Bax蛋白水平 取大鼠心肌組織經勻漿離心后，取上清液用BCA法測定蛋白濃度。取各組樣品30 μg進行15%SDS-PAGE并電轉移至PVDF膜上，室溫封閉1 h。以1∶1000用5%BSA-TBST稀釋一抗，4℃孵育過夜。然后按1∶10000比例稀釋HRP二抗，室溫下孵育40 min。ECL反應3～5 min，膠片曝光10 s～5 min顯影、定影、洗片。膠片掃描后進行圖像分析，以β-actin作為內參照對比，比值結果表示其蛋白的相對含量。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 栝樓薤白半夏湯對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清CK、LDH-L表達的影響

表1顯示，與假手術組比較，MI/RI模型組大鼠血清CK、LDH-L含量顯著增高，差異有統計學意義(均為P＜0.01);與模型組比較，3-MA干預組及栝樓薤白半夏方組能降低血清CK及LDH-L水平，差異有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)，2組之間比較差異無統計學意義(P﹥0.05)。

3.2 栝樓薤白半夏湯對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌Beclin-1、LC3II及促凋亡蛋白Bax表達的影響

表1、2及圖1顯示，與假手術組比較，模型組Beclin-1蛋白表達及LC3II/LC3I比值升高，同時促凋亡蛋白Bax表達也顯著上升(均為P＜0.01);與模型組比較，3-MA干預組及栝樓薤白半夏方組能顯著下調Beclin-1、LC3II、Bax蛋白表達及LC3II/LC3I比值(P＜0.01或P＜0.05)，且栝樓薤白半夏方組Beclin-1蛋白水平明顯低于 3-MA干預組(P＜0.05)。再灌注后，各組間LC3I蛋白表達比較差異無統計學意義。

將模型組Beclin-1、LC3II蛋白表達與Bax表達進行相關性分析，結果顯示兩者均具有正相關關系(r=0.666，0.575，P＜0.01)。提示隨著再灌注后自噬高表達的同時，促凋亡蛋白Bax水平也相應顯著升高。

表1 各組大鼠血清心肌酶CK、LDH及心肌Beclin-1、Bax蛋白表達情況(±s)

表1 各組大鼠血清心肌酶CK、LDH及心肌Beclin-1、Bax蛋白表達情況(±s)

注:與假手術組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與3-MA組比較:■P＜0.05，■■P＜0.01

組別 鼠數 CK/U·L LDH/IU·L Beclin-1 Bax假 手 術 組 8 1661.75±534.23 1235.35±602.73 0.15±0.03 0.21±0.03模 型 組 8 3136.75±875.09ΔΔ 2723.31±823.58ΔΔD 0.32±0.09ΔΔ 0.56±0.06ΔΔ3-MA 干 預 組 8 2340.88±766.21* 1747.00±725.11＊＊ 0.24±0.05* 0.33±0.09＊＊栝樓薤白半夏方組 8 2454.75±354.79* 2000.51±612.74* 0.15±0.05＊＊■ 0.30±0.04＊＊

表2 各組大鼠心LC3I、LC3II蛋白表達及LC3II/LC3I比值情況(±s)

表2 各組大鼠心LC3I、LC3II蛋白表達及LC3II/LC3I比值情況(±s)

注:與假手術組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數LC3I LC3II LC3II/LC3I假 手 術 組8 0.53±0.01 0.07±0.05 0.13±0.10模 型 組 8 0.39±0.11Δ 0.24±0.08ΔΔ 0.60±0.05ΔΔ3-MA 干 預 組 8 0.45±0.12 0.13±0.11* 0.28±0.18＊＊栝樓薤白半夏方組 8 0.42±0.04* 0.11±0.06* 0.27±0.11＊＊

圖1 各組大鼠心肌Beclin-1、LC3II、Bax蛋白表達

4 討論

心肌壞死是心肌缺血再灌注損傷可能導致的最嚴重結果，心肌缺血壞死或細胞膜通透性增加，可使心肌內的細胞酶釋放入血，因而血清心肌酶可以反映心肌梗死的發生以及病灶的大小，是判斷心肌壞死程度的重要指標之一。本實驗中采用CK、LDH的釋放為觀測指標，觀察到再灌注后大鼠血清CK、LDH含量顯著增加，表明缺血再灌注損傷后心肌細胞受損嚴重，而栝樓薤白半夏湯對MI/RI心肌具有一定的保護作用，減輕了心肌細胞膜的損傷，降低了心肌酶的釋放，從而改善能量代謝障礙，保護心肌細胞。

自噬在維持機體穩態、對抗外界環境變化、應激和炎癥反應方面起著重要作用，當自噬出現過表達或應激和炎性反應強烈，自噬的保護作用就會轉化成自噬性細胞死亡或凋亡［5］。心肌缺血本質上也是血流供應不足導致的營養物質缺乏，因此自噬可以被缺血誘導，而且再灌注過程會促進自噬體的形成。在心臟再灌注階段，氧化應激、線粒體損傷及炎癥反應等可使自噬過度激活，從而過度降解重要蛋白和細胞器會誘導細胞不可逆死亡［6］。Beclin-1是調節細胞自噬過程的關鍵基因，Beclin-1的表達水平一定程度上反映了自噬的活性。LC3是自噬標志性蛋白，分為2個亞型，在細胞自噬形成過程中，LC3Ⅰ被剪形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ在細胞自噬泡形成過程中起到重要作用［7］。因此，在應激情況下LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的比值可以反映自噬被激活的程度。本實驗研究顯示，再灌注后大鼠心肌Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高，說明此時心肌自噬被激活且維持過表達水平，栝樓薤白半夏湯具有與自噬抑制劑3-MA作用相當的抑制自噬效應。

MI/RI過程中，細胞凋亡是MI/RI重要的病理環節之一，是心肌缺血及再灌注細胞死亡的一種主要形式［8］。凋亡亦與自噬之間存在密切的內在聯系，有研究［9］利用創傷后遲發性心臟損傷模型發現，自噬和凋亡既相互獨立又存在相互作用，低水平的自噬具有保護作用，可以抑制凋亡;當自噬調節不當或過度時，可以誘發凋亡或壞死，且相關性分析顯示，自噬與凋亡的發生密切相關。以往研究證明［10］，在Bcl-2/bcl-XL低表達、Bax過表達的細胞中，抗凋亡能力受到抑制，可通過Caspase-3依賴的Beclin-1裂解以降低自噬水平;而在抗凋亡Bcl-2的蛋白高表達的細胞中，Bax中止 Bcl-2/bcl-xl和Beclin-1的相互作用以加強自噬，從而進一步解釋了本實驗的結果。

自噬在缺血再灌注損傷中發揮著重要作用，自噬的變化直接關聯著心肌細胞的存亡。本實驗結果說明，MI/RI后心肌血清心肌酶水平升高，自噬表達迅速上調，心肌凋亡嚴重，栝樓薤白半夏湯可以通過抑制自噬過表達，減輕凋亡反應，發揮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

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Effects of Gualou Xiebai Banxia Decoction on the Myocardial Autophagy and Apoptosis in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

TANG Dan-li1，LIU Zhai-hua2，CUI Hai-feng1，ZHOU Yan-hua1，SUI Yu1，ZHANG Hua-min3△
(1．Experimental Research Center of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China; 2．Institute of Basic Theory for Chinese Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China; 3．Institute of Information on Chinese Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China)

Objective:To study the effects of Gualou Xiebai Banxia decoction(GXBD)on autophagy and antiapoptosis of myocardial ischemia-reperfusion injury(MI/RI)in rats．Methods:40 SD rats were randomly divided into sham-operated group，model group，3-MA and GXBD groups．The model of ischemia reperfusion of the myocardium was reproduced by ligation of left descending artery for 30 min and followed by releasing the ligation for 2 hours in rats．Serum contents of CK，LDH were measured by automatic biochemical analyzer，the protein expression of Beclin-1、LC3II，Bax and the level of LC3 II/LC3I were determined by Western blot．Results:Compared with the sham-operated group，the contents of CK、LDH and the protein expression of Beclin-1，LC3 II，Bax and the level of LC3 II/LC3I were both significantly increased in MI/RI model groups;Compared with the model group，the 3-MA and GXBD groups down-regulated the expression of Beclin-1，LC3II，Bax and LC3 II/LC3I．The level of Beclin-1 in GXBD group were decreased than that in 3-MA group(P!0.05)．Conclusion:Autophagy and apoptosis were induced and activated by MI/RI，GXBD may protect cardiomyocytes of MI/RI rats by inhibiting autophagy and reducing apoptosis．

Myocardial ischemia-reperfusion injury;Autophagy;Apoptosis;Gualou Xiebai Banxia decoction (GXBD)

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0177-04

2015-06-17

國家自然科學基金資助項目(81202630)-痰瘀同治法對心肌缺血再灌注損傷中核轉錄因子-κB與自噬交互作用的調控機制研究;國家自然科學基金資助項目(81373792)-痰瘀同治法對MI/RI中IKK/NF-κB-PI3K/Akt信號轉導網絡與自噬間交互作用的調控機制研究;中國中醫科學院自主選題項目(ZZ2014002)-栝樓薤白半夏湯對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用中自噬及凋亡調控效應的影響

唐丹麗(1979-)，女，山東人，副研究員，醫學博士，從事中醫藥防治心血管疾病的臨床與研究。

△通訊作者:張華敏，女，研究員，醫學博士，從事中醫藥防治心血管疾病的臨床與研究，E-mail:zhanghm@mail．cintcm．ac．cn。