冠心Ⅴ號合劑干預急性心肌梗死模型大鼠心室重構及心肌TLR4 信號通路研究*

左可可，柯 峰，顧 寧

(1．南京市中醫院，南京 210001;2．南京中醫藥大學第三附屬醫院，南京 210001)

冠心Ⅴ號合劑干預急性心肌梗死模型大鼠心室重構及心肌TLR4 信號通路研究*

左可可1，柯 峰1，顧 寧2△

(1．南京市中醫院，南京 210001;2．南京中醫藥大學第三附屬醫院，南京 210001)

目的:觀察冠心Ⅴ號合劑對急性心肌梗死(AMI)模型大鼠心室重構及心肌TLR4信號通路的影響。方法:雄性SD大鼠56只，采用冠狀動脈左前降支結扎法建立急性心肌梗死模型，分別給予冠心Ⅴ號合劑小劑量(0.5 g/ml)、中劑量(1 g/ml)、大劑量(2 g/ml)及血脂康膠囊連續干預4周，以心臟彩超觀察心臟結構及心功能，熒光定量PCR法檢測TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達。結果:模型組實驗大鼠心功能明顯下降，梗死區心肌組織TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達上調，與空白組、假手術組比較差異有統計學意義;藥物干預組各組上述指標均低于模型組;冠心Ⅴ號合劑大劑量組上述指標低于余治療組，差異有統計學意義。結論:冠心Ⅴ號合劑能夠抑制急性心肌梗死大鼠TLR4信號通路并改善心室重構。

心肌梗死;心室重構;冠心Ⅴ號合劑;TLR4信號通路

Toll樣受體4(TLR4)是第一個被發現的哺乳動物TLR，是天然免疫系統的一種模式識別受體，參與急性心肌梗死(AMI)后心室重構的發生發展。冠心Ⅴ號合劑是南京中醫藥大學第三附院的院內制劑，已在臨床應用多年。本課題組前期研究表明，該藥可改善心梗后大鼠的血流動力學，促進缺血心肌細胞的心肌收縮力恢復，改善心肌細胞的能量代謝，降低心肌部位的血管緊張素1受體和升高AT2受體，在一定程度上改善心梗后大鼠的心室重構［1］。本研究進一步從分子生物學角度探討冠心Ⅴ號合劑通過抑制TLR4信號通路、干預心肌梗死后心室重構的作用機制。

1 材料

1.1 動物

健康雄性 SD大鼠56只，6～7周齡，體質量(220±10)g，由南京中醫藥大學動物實驗中心購于浙江省醫學科學院實驗動物中心(許可證號SUXK (浙)20080033)。

1.2 主要藥品、試劑和儀器

冠心Ⅴ號合劑由黨參、麥冬、丹參、赤芍、制五味子、地黃組成，由南京中醫藥大學第三附屬醫院藥劑科制備(蘇藥制字Z04000795)。血脂康膠囊由北大維信生物科技有限公司提供(批準文號國藥準字Z10950029)，引物由上海生工生物有限公司提供。逆轉錄試劑盒、熒光定量 PCR試劑盒、Trizol均由TaKaRa公司提供。主要儀器設備包括小動物呼吸機(ALC-V8)，上海奧爾科特生物科技有限公司;心電圖機，SHANGHAI KOHDEN Medical Electronic Instrument Corporation;小動物高頻彩色超聲儀(VisualSonics Vevo2100)，探頭MS-250，頻率21 MHz;7500 Real-Time PCR System，Applied Biosystems公司生產。

2 方法

2.1 分組與動物模型制備

56只SD大鼠適應性喂養1周后稱重，取14只隨機分為空白組與假手術組，剩余大鼠行左冠狀動脈前降支結扎術造模。造模動物經10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉后，四肢皮下連接心電圖機電極，記錄標準Ⅱ導聯心電圖，經口行氣管插管后接小動物呼吸機通氣，潮氣量7～8 ml，吸呼比3∶2，呼吸頻率90次/min。沿左胸第3～4肋間水平依次剪開皮膚，逐層分離皮下組織、肌肉，暴露心臟，撕開心包，用6-0號線于左心耳下緣2 mm縫扎左前降支;觀察到結扎線以下心肌變白，心肌運動減弱(連接心電圖見Ⅱ導聯ST段上抬0.2 mV)提示心肌梗死。逐層關閉胸腔(邊縫合邊擠壓胸腔內的殘余氣體)。假手術組手術方法同前，但在該血管下穿線后不打結。空白對照組不作任何手術。造模成功大鼠隨機分為模型組、冠心Ⅴ號合劑小劑量組、冠心Ⅴ號合劑中劑量組、冠心Ⅴ號合劑大劑量組、血脂康組。

2.2 給藥方法

除空白組外的6組大鼠于術后24 h開始灌胃，每只大鼠灌胃體積為1 ml/(100 g·d)。冠心Ⅴ號合劑小劑量組含生藥量0.5 g/ml，冠心Ⅴ號合劑中劑量組含生藥量1 g/ml，冠心Ⅴ號合劑大劑量組含生藥量2 g/ml，血脂康組將血脂康膠囊溶為12.5 mg/ ml灌胃，每日1次;模型組、假手術組均給予等容量生理鹽水灌胃，每日1次。連續灌胃28 d后，7組大鼠經10%水合氯醛腹腔麻醉處死。

2.3 心臟超聲心動圖評價心功能

各組大鼠在造模第28天時行超聲心動圖檢查，使用超聲儀探頭頻率21 MHz。大鼠麻醉后固定于鼠板上，取胸骨旁左室長軸切面，由二維超聲引導M型曲線測量EF值、FS值、左室質量(LVmass)，計算大鼠體表面積 (BSA，m2)=0.09x［體質量(kg)］2/3;左室心肌質量指數(LVMI，g/m2)=實測LVM/BSA。

2.4 熒光定量PCR檢測

各組大鼠隨機取5只進行檢測。稱取梗死區心肌組織50 mg，用Trizol法提取總RNA，并用紫外分光光度儀測定RNA濃度及A260/A280值，所測得樣品吸光度A260/A280為1.8～2.0。逆轉錄后應用熒光定量PCR法檢測TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達(引物見表1)。反應條件依據Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System設定，退火溫度為58℃。

2.5 統計學方法

采用SPSS 15.0軟件進行統計分析，實驗數據經正態性檢驗后以均數±標準差(±s)表示，組間多樣本均數比較經方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

實驗過程中，實驗大鼠因呼吸暫停死亡8只，心臟驟停死亡9只，灌胃死亡1只。最終納入統計的動物數量為空白組7只，假手術組6只，模型組、冠心Ⅴ號合劑小劑量組、冠心Ⅴ號合劑中劑量組、冠心Ⅴ號合劑大劑量組、血脂康組各5只。

3.1 心臟彩超檢測結果

表1圖1顯示，與空白組、假手術組比較，模型組實驗大鼠心功能指標EF、FS值明顯下降，LVMI增高，差異有統計學意義(P＜0.05);與模型組比較，各藥物干預組EF、FS增高，LVMI下降，差異有統計學意義(P＜0.05);與血脂康組比較，冠心Ⅴ號大劑量組EF、FS增高，LVMI下降更明顯，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠治療28 d后心臟彩超比較(±s)

表1 各組大鼠治療28 d后心臟彩超比較(±s)

注:與空白組、假手術組比較:*P＜0.05;與模型組比較:△P＜0.05;與血脂康組比較:▲P＜0.05

組別 鼠數 EF(%) FS(%) LVMI(g/cm2)空白組773.911±1.023 43.488±0.521 0.134±0.005假 手 術 組 6 71.410±1.100 40.221±1.971 0.171±0.006模型組 5 52.041±1.839* 27.759±1.058* 0.240±0.013*血 脂 康 組 5 60.885±0.936△ 33.621±1.565△ 0.168±0.006△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 小 劑 量 組 5 59.130±1.329△ 31.874±1.129△ 0.179±0.006△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 中 劑 量 組 5 60.817±0.911△ 34.074±1.037△ 0.168±0.008△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 大 劑 量 組 5 62.672±1.404△▲ 35.258±0.807△▲ 0.157±0.006△▲

3.2 熒光定量PCR檢測結果

表2顯示，模型組大鼠梗死區心肌組織TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達上調，與空白組、假手術組比較差異有統計學意義(P＜0.05);藥 物 干 預 組 各 組 TLR4mRNA、 Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達均低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05);冠心Ⅴ號各劑量組TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達與藥物濃度成反比，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 實驗藥物對AMI大鼠心肌組織TLR4、Myd88、NF-κB mRNA表達的影響(±s)

表2 實驗藥物對AMI大鼠心肌組織TLR4、Myd88、NF-κB mRNA表達的影響(±s)

注:與正常組、假手術組比較:*P＜0.05;與模型組比較:△P＜0.05;與血脂康組比較:▲P＜0.05

組別 鼠數 TLR4mRNA Myd88mRNA NF-κBmRNA空白組50.5 0.5 0.5假 手 術 組 5 1.194±0.040 1.081±0.020 1.094±0.015模型組 5 2.078±0.129* 1.926±0.047* 1.986±0.098*血 脂 康 組 5 1.485±0.006△ 1.450±0.024△ 1.475±0.021△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 小 劑 量 組 5 1.729±0.133△ 1.682±0.087△ 1.667±0.054△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 中 劑 量 組 5 1.477±0.053△ 1.430±0.053△ 1.465±0.045△冠 心 Ⅴ 號 合 劑 大 劑 量 組 5 1.292±0.033△▲ 1.317±0.029△▲ 1.357±0.048△▲

圖1 各組大鼠心臟彩超

4 討論

TLR4是天然免疫系統的一種模式識別受體，介導機體的天然免疫反應。TLR4介導的信號傳導可分為髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴性和非依賴性2個途徑，MyD88途徑主要介導炎性細胞因子產生。TLR4與配體結合后使其本身二聚化，然后通過TIR結構域與MyD88羧基端相互作用，MyD88氨基端的結構域與絲/蘇氨酸IRAK的氨基端相互作用，引起IRAK自身磷酸化，活化腫瘤壞死因子受體 6 (TRAF-6)。活化后的TRAF-6通過適配體蛋白激活TGF-β活化激酶1，最終通過活化核因子抑制蛋白I-κB導致NF-κB的激活和轉位，NF-κB的激活可誘導炎性細胞因子的合成和釋放。研究表明，動脈粥樣硬化斑中TLR4的表達明顯增高，并進一步激活NF-κB誘導與冠狀動脈粥樣硬化相關炎癥細胞因子的合成與釋放［2］。TLR4基因缺乏的大鼠心肌梗死范圍及炎性反應明顯減少［3］，抑制TLR下游信號通路分子，如MyD88、NF-κB也能減輕心肌缺血再灌注損傷，表明TLR/MyD88/NF-κB信號通路的激活參與缺血再灌注心肌損傷的發生和進展［4-5］。TLR4可能成為干預心肌梗死后心室重構炎癥反應的目標，干預TLR4信號可能抑制炎癥反應，值得進一步研究。

中醫藥在TLR4信號通路的治療中發揮著一定的作用。丹參酮是丹參的主要有效成分，已有研究［6］證實，丹參酮ⅡA可抑制 LPS誘導的EAhy926細胞TLR4表達，從而干預TLR4/NF-κB信號通路激活。張云［7］等研究表明，由丹參總酚酸、三七總苷和銀杏葉黃酮組成的活血安心方，通過抑制 TLR4-NFκB-TNFα通路激活來顯著改善AMI大鼠心肌缺血損傷導致的心臟形態結構和功能異常。

中藥“冠心Ⅴ號合劑”是獲得江蘇省食品藥品監督管理局批準的醫院院內制劑(蘇藥制字Z04000795)，已在臨床應用多年。方中黨參補中益氣、健脾益肺，麥冬養陰潤燥、清心除煩，五味子斂肺止汗、生津止渴、補腎寧心，赤芍行瘀止痛、涼血消腫，丹參活血祛瘀、安神寧心，生地清熱涼血、養陰生津，本方6味藥物合用，益氣、養陰、涼血、化瘀相得益彰。現代藥理研究表明，黨參水溶液可調節心肌收縮力，增強心臟泵血功能，增加心輸出量，從而對缺血再灌注損傷后的心肌組織起到營養保護作用［8］。赤芍總苷可穩定心肌細胞膜，清除自由基和抑制心肌細胞早期凋亡，保護心肌細胞［9］，而赤芍有效成分赤芍801可降低AMI大鼠血清炎癥因子TNF-α水平，抑制缺血心肌組織COX-2、ICAM-1表達，從而減輕AMI大鼠心肌損傷［10］。麥冬通過抑制p-Smad2/3和Smad2/3及TGF-β1蛋白表達，減少大鼠心肌纖維化［11］。丹參水溶性提取物具有增強冠狀動脈血流量、抗脂質過氧化、抑制血小板聚集、血栓形成及改善微循環等作用［12-13］。前期研究表明，冠心Ⅴ號對心肌組織具有一定的保護作用，但未明確其作用機制。本研究結果顯示，AMI大鼠心功能明顯下降，心梗死區心肌組織 TLR4mRNA、Myd88mRNA、NF-κBmRNA表達上調，治療后各組心功能顯著改善，基因表達明顯下降，治療效果與藥物濃度成反比，表明冠心Ⅴ號合劑能夠抑制 TLR4-Myd88-NF-κB信號通路，并改善心室重構，以冠心Ⅴ號合劑大劑量組療效最優。

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Guanxin V Mixture Intervention on the Ventricular Remodeling and Myocardial TLR4 Signal Pathway in Rat Model of Acute Myocardial Infarction

ZUO Ke-ke1，KE Feng1，GU Ning2△
(1．Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 2．The Third Afficiated Hospital Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210001，China)

Objective:Observing the effect of Guanxin V mixture on ventricular remodeling and TLR4 signaling pathway in myocardial Tissue in rats with acute myocardial infarction．Methods:56 male SD rats，establishing the model of acute myocardial infarction by left anterior descending coronary artery ligation．All of them were treated with low Guanxin V mixture dose(0.5 g/ml)，medium dose(1 g/ml)，high dose(1 g/ml)and Xuezhikang Capsule for 4 weeks，To observe the cardiac structure and function by echocardiography，Fluorescence quantitative PCR technique was used to detect the expression of TLR4mRNA，Myd88mRNA，NF-κBmRNA．Result:Compared with the normal group and sham operation group，the expression of TLR4mRNA，Myd88mRNA，NF-κBmRNA in model rats were up-regulation，the difference were statistically significant，Drug intervention group were lower than those in the model group，the difference were statistically significant．The mRNA expression of Guanxin V mixture groups are proportional to the concentration of each drug，the difference was statistically significant．Conclusion:Guanxin V mixture can inhibit TLR4 signal pathway，and improve ventricular remodeling．

Myocardial infarction;Ventricular remodeling;Guanxin V mixture; TLR4 signal pathway

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0181-03

2015-06-12

南京市衛生局醫學科技發展重點項目(201108005)-冠心Ⅴ號合劑改變劑型及干預心肌TLR4信號通路改善AMI后心室重構機制研究;江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目(CXZZ13_ 0611)-基于心肌TLR4信號通路冠心Ⅴ號干預AMI后心室重構機制

左可可，女，河南人，從事中醫及中西醫結合心血管疾病的臨床與基礎研究。

△通訊作者:顧 寧，男，教授，主任醫師，醫學博士，Tel:025-52276242，E-mail:guning@medmail．com．cn。