補腎活血法對腎虛血瘀型大鼠雌、孕激素及其受體的影響*

馮玉霞，王田平，曾 倩△，王 毅，黃金珠，鄧琳雯，韓雪梅

(成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610072)

補腎活血法對腎虛血瘀型大鼠雌、孕激素及其受體的影響*

馮玉霞1，王田平1，曾 倩1△，王 毅2，黃金珠2，鄧琳雯3，韓雪梅3

(成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610072)

目的:探討補腎活血法對腎虛血瘀型大鼠雌孕激素及其受體的影響。方法:選動情前期大鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、補腎活血方藥低劑量組、高劑量組和五子組造腎虛血瘀模型，妊娠第4天處死大鼠，留取血清及子宮標本，放射免疫法測定血清雌二醇(E2)、孕酮(P)，免疫組化結合圖像分析系統檢測子宮雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)含量。結果:模型組E2、P、ER、PR明顯低于空白組;各治療組E2和P、高劑量組ER和PR、低劑量組和五子組的PR比模型組明顯升高。多元相關性分析，ER、PR與E2呈正相關，間質PR與P呈正相關。結論:補腎活血法可升高腎虛血瘀型大鼠E2、P水平，調控ER、PR表達，利于子宮內膜成熟及胚泡著床。

補腎活血法;雌激素;孕激素;雌激素受體;孕激素受體;子宮內膜容受性

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級健康SD未交配雌性大鼠70只，體質量190～240 g，同品系有生育能力雄性大鼠16只，體質量250～280g，購自成都中醫藥大學實驗動物中心(合格證號scxk(川)2008-11)。雌雄分籠飼養，給予12 h光照、12 h避光，室內溫度(22±1)℃，相對濕度約為40%，給予標準飼料和飲用水。

1.2 藥物

補腎活血方藥(即助孕I號方)制備:菟絲子、枸杞子、覆盆子、丹參等(由成都中醫藥大學附屬醫院制劑室提供，批號20130327)按一定比例制成含生藥3.14 g/ml的無菌煎劑，置4℃冰箱冷藏備用;羥基脲片:北京嘉林藥業股份有限公司(批號130203);高分子右旋糖苷:上海金穗生物科技有限公司(批號JS11715);五子衍宗丸:太極集團四川綿陽制藥有限公司(批號1306011)。

1.3 試劑及器材

E2(批號RG61312)、P(批號RG51312)放免試劑盒購自天津九鼎醫學生物工程有限公司;一抗ER (克隆號 6136518，兔抗鼠多克隆抗體)購自BeacomBio公司;PR(克隆號Y-B4-07C17B，兔抗鼠多克隆抗體)購自武漢博士德生物工程有限公司，二抗及相應試劑盒購自北京中杉生物有限公司; BX43正置顯微鏡購自 OLYMPUS公司(型號BSA224S-CW)。

1.4 分組及建立模型

參照《動物試驗方法學》［7］，選擇陰道涂片顯示為動情前期大鼠50只，按隨機數字表法分為空白組、模型組、補腎活血方藥低劑量組、高劑量組和五子組。建立腎虛血瘀型大鼠模型［8-10］:空白組給予蒸餾水5 ml/kg灌胃，其余各組給予羥基脲450 mg/ (kg·d)連續灌胃8 d，空白組、模型組給予蒸餾水5ml/kg灌腸，低劑量組、高劑量組分別給予補腎活血方7.3 g/kg、14.6 g/kg灌腸，五子組給予五子衍宗丸溶液1.68 g/kg灌胃。第9天以后早晨9∶00陰道涂片，若發現膨大的上皮細胞核消失，成為鱗狀脫落的角化上皮細胞，并聚集像許多落葉堆積占細胞的絕大多數，白細胞和有核上皮細胞很少，認為動情期則選各組動情期雌鼠按雌雄2∶1合籠，次日早晨9∶00陰栓或陰道涂片發現精子認為合籠成功，記為妊娠第1天，繼續給藥至妊娠第4天，末次給藥后1 h尾靜脈快速推注高分子右旋糖苷5 ml/kg。

施肥器主要采用不銹鋼材料制成，料倉等部件采用ABS工程塑料，保證產品強度的同時也使得產品質量較輕易于攜帶。施肥器整體結構簡單，結實耐用，易于維修維護，大大降低了產品成本。下料量、踏板高度均可進行調節，可以滿足不同作業需求。把手加設軟性膠墊，使手部操作更加舒適。其工作效率明顯高于無專項農具輔助的手工作業，作業成本又大幅度低于大型機器，而且適應各種復雜環境，造型簡潔大方，價格低廉，多數農戶都可以接受，此設計方案應有較好的市場前景。

1.5 檢測血清E2、P水平

末次給高分子右旋糖苷30 min后股動脈取血，取上清液用放射免疫分析法測定血清E2、P水平。

1.6 檢測子宮內膜ER、PR含量

取血后脫頸處死大鼠，剖腹取出子宮放入FAA液固定，逐級酒精脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，切片厚度4 um，子宮切片做免疫組化染色，操作按照說明書進行。ER、PR免疫組化結果判定，ER、PR陽性物質呈棕黃色、黃色、淺黃色顆粒狀或細絲狀，陽性物質表達于胞漿、胞核。光鏡下觀察切片，先在低倍(100×)下選取5個上皮、間質陽性物質表達最明顯區域，然后在中倍(200×)視野下攝入上述5個區域圖像，采用Mias-2000圖形圖像分析系統(四川川大智勝軟件股份有限公司)分別測量上皮、間質ER、PR積分光密度，求5個區域積分光密度總和，分別表示上皮、間質ER、PR含量。

1．7 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，對數據進行正態分布檢驗和方差齊性檢驗，若2項檢驗均符合則采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，對不滿足任一檢驗的數據，采用非參數統計中多個獨立可Kruskal-Wallis H檢驗統計處理，組間比較采用Mann Whitney U法檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠妊娠第4天血清E2、P比較

表1顯示，與空白組比較，模型組E2、P均明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較，補腎活血法高、低劑量組、五子組E2明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較，高劑量組P明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，低劑量組、五子組P升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠妊娠第4天血清E2、P比較(±s)

表1 各組大鼠妊娠第4天血清E2、P比較(±s)

注:與空白組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別 鼠數 雌二醇(pg/ml) 孕酮(ng/ml)空 白 組10 26.73±3.01 78.28±19.27模 型 組 10 11.00±3.26＊＊ 39.88± 2.83＊＊低劑量組 10 19.48±6.05▲▲ 61.08±14.19▲高劑量組 10 21.80±2.73▲▲ 75.41±19.42▲▲五 子 組 10 18.96±5.56▲▲ 63.27±20.68▲

圖1 各組大鼠妊娠第4天ER免疫組化染色(×200)

2.2 各組大鼠妊娠第4天ER、PR比較

圖1、2顯示，在光鏡下觀察ER、PR在大鼠子宮內膜組織上皮、間質均有表達，空白組上皮、間質ER表達呈棕黃色、黃色，分布密集，面積廣;模型組上皮、間質ER、PR表達呈黃色、淺黃色，分布稀疏，面積較小;與模型組比較，低、高劑量組和五子組ER、PR表達均有不同程度的增加，呈棕黃色、黃色，分布密集，面積廣。

表2顯示，與空白組比較，模型組ER、PR表達均明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較，高劑量組ER和PR、低劑量組和五子組的PR表達升高，差異有統計學意義(P＜0.05);高劑量組ER表達高于低劑量組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠妊娠第4天PR免疫組化染色(×200)

表2 各組大鼠妊娠第4天ER、PR比較(±s)

表2 各組大鼠妊娠第4天ER、PR比較(±s)

注:與空白組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，與劑低量組比較:◆P＜0.05

組 別 鼠數 ER 積分光密度總和 PR 積分光密度總和上皮 間質 上皮 間質空 白 組 10 34165.28±6948.37 78513.04± 7805.07 54463.89±36090.88 57665.89± 7494.60模 型 組 10 23876.39±3856.66＊＊ 59270.54± 6332.64＊＊ 36090.8±12321.30＊＊ 41709.40±12394.70＊＊低劑量組 10 28222.86±3078.15 62765.79±11812.11 48566.19± 6630.18▲ 52089.59± 5561.43▲高劑量組 10 30821.62±4123.59▲ 72398.86±10309.16▲◆ 49325.08± 8370.49▲ 53548.17± 7893.27▲五 子 組 10 26617.64±3272.87 59285.16± 8430.48 48151.89± 3749.00▲ 51814.19± 6693.76▲

2.3 多元相關性分析

表3顯示，上皮和間質的ER、PR與E2水平呈正相關，間質PR與P水平呈正相關，上皮與間質ER、上皮PR與P無直線相關關系。

表3 各組大鼠妊娠第4天上皮和間質ER、PR與E2、P多元相關性分析

3 討論

子宮內膜容受性［11］是指子宮內膜處于一種允許囊胚定位黏附侵入并使內膜間質發生改變，從而導致胚胎著床的狀態。在著床期，子宮內膜在雌、孕激素作用下發生一系列與胚泡發育同步，并有利于胚泡著床的形態結構變化，對胚泡具有容受性，能使胚泡順利著床［12］。雌、孕激素通過各自的細胞內受體作用于內膜組織，使子宮內膜腺體和間質增生發育，為胚胎著床提供物質基礎。研究發現［13］，COH明顯干擾了子宮內膜腺上皮ER、PR的正常表達，使內膜腺上皮細胞ER、PR的陽性細胞表達率下降，影響子宮內膜胞飲泡的正常發育，致內膜發育延遲，也影響子宮內膜發育的成熟度。本實驗發現，模型組E2、P、ER、PR比空白組明顯降低，說明腎虛血瘀會導致E2、P分泌降低，抑制ER、PR表達，影響子宮內膜的形態、功能，降低子宮內膜容受性，從而影響胚胎著床。補腎活血法低、高劑量組和五子組的E2、P比模型組高，高劑量組的ER和PR、低劑量組和五子組的PR表達比模型組升高，說明補腎法和補腎活血法可升高E2、P水平，改善腎虛血瘀對ER、PR表達的抑制，增加ER、PR在子宮內膜表達，改善子宮內膜容受性。

研究［14］發現，血清E2與子宮內膜ER、PR表達呈正相關，有刺激ER、PR合成的作用，血清P與ER、PR表達呈負相關，抑制ER合成，并間接抑制PR合成的作用。而腺上皮的PR下調和間質細胞P上調的失敗是導致子宮內膜容受性下降的原因之一［15-16］。劉子霞［17］等研究發現，IVF-ET助孕患者妊娠組P可下調腺上皮PR和上調間質PR表達，非妊娠組P下調腺上皮PR失敗的結果一致。本試驗發現，用藥組E2、P、ER、PR明顯高于模型組，且低于空白組，但差異無統計學意義。多元相關分析發現，E2與ER、PR呈正相關，P與間質PR呈正相關。由此可以推測，補腎活血法可升高E2、P，E2、P上調上皮、間質ER和間質PR表達，使E2、P、ER、PR提高到正常范圍內，促進子宮內膜蛻膜化，從而改善子宮內膜結構、功能，提高子宮內膜容受性，促進著床。

中醫學無“子宮內膜容受性”相關概念，根據“子宮內膜容受障礙”證候屬于“不孕癥”“滑胎”“胎漏、胎動不安”“月經失調”等范疇，與“腎氣”“氣血”有密切聯系［18］。前期研究已證實，其主要為腎虛血瘀證。現代醫家認為［19］，腎陰是卵泡的物質基礎，腎陽是促使其生長發育以及黃體形成的動力。若腎虛則胞宮胞脈失于濡養，血瘀則胞宮胞脈血行瘀滯不暢，胞宮受納失常，妨礙妊娠。現代藥理研究，楊鑒冰［20］臨床研究證明，補腎中藥有促進黃體功能的作用，且能直接或間接作用于卵巢，促使P合成和分泌，提高和延長P分泌高峰期。有研究發現［21］，資沖顆粒直腸給藥和灌胃給藥均具有促進幼齡大鼠卵泡發育的作用和增加雌激素樣效應。張明敏［22］實驗研究發現，將補腎法和活血法結合起來的補腎安胎方可提高E2、P及促進PR、ER表達，能更大程度上改善著床障礙小鼠子宮內膜容受性，促進胚泡著床。補腎活血方通過補腎中陰陽、活血通絡使胞宮胞脈得以滋養，胞脈胞絡血行暢達，兩精相搏，使胞宮受納才能妊娠。

補腎活血方藥由菟絲子、枸杞子、覆盆子、丹參等組成。研究證實，菟絲子含有糖類、黃酮類化合物等，有雌激素樣活性［23］;覆盆子能調控下丘腦-垂體-性腺功能［24］;枸杞子具有抗氧化、抗衰老、免疫調節以及保護生殖系統的作用［25］;丹參能改善微循環，促進血液流速，能改善血液流變性，降低血液黏度，抑制血小板聚集和凝血功能，激活纖溶，對抗血栓形成［26］。全方配伍可促進E2、P分泌和ER、PR表達，改善微循環障礙，對腎虛血瘀型大鼠有療效。

綜上所述，補腎活血法可以改善腎虛血瘀型大鼠的子宮內膜容受性，其作用機制可能是升高E2、P水平，調控ER、PR表達，利于子宮內膜成熟和胚泡著床。

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Effect of Bushen Huoxue Method on Estrogen，Progesterone and Its Receptor in Rats with Kidney Deficiency and Blood Stasis

FENG Yu-xia1，WANG Tian-ping1，ZENG Qian1△，WANG Yi2，HUANG Jin-zhu2，DENG Lin-wen3，HAN Xue-mei3
(The Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China)

Objective:To study the effects of tonifying the kidney and promoting blood circulation on estrogen and progesterone and their receptors in rats with kidney deficiency and blood stasis type．Method:the proestrus rats were randomly divided into blank group，model group，both low and high dose group of Bushen Huoxue recipe and the five sub group，made of kidney deficiency and blood stasis model，and killed on day 4 of pregnancy．Samples of their serum and uterine were collected for detecting serum estradiol(E2)，progesterone(P)using radioimmunoassay;and endometrial expression contents of their receptors，ER and PR using immunohistochemistry and image analysis system．Results:E2，P，ER and PR of the model group were significantly lower than blank group;E2and P of the treatment group，ER and PR of high dose group，PR of low dose group and five sub group increased than the model group．Multivariate correlation analysis，ER，PR and E2were positively correlated，interstitial PR and P were positively．Conclusion:tonifying kidney and promoting blood circulation can improve E2，P level of kidney deficiency and blood stasis rats，and regulate the expression of ER，PR to improve endometrial maturation so as to conducive to blastocyst implantation．

Tonifying the kidney and promoting blood circulation;Estrogen;Progesterone;Estrogen receptor; Progesterone receptor; Endometrial receptivity

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0191-04

2015-06-24

四川省教育廳科研基金資助項目(13ZA0284)-基于細胞外機制分子網絡研究補腎活血法改善子宮內膜容受性的作用機理;成都市科技局科研基金資助項目(H2013050)-助孕I號方經直腸給藥對腎虛血瘀模型大鼠生殖功能的調控機制研究

馮玉霞(1987-)，女，甘肅人，醫學碩士，從事不孕癥的中醫藥防治與研究。

△通訊作者:曾 倩(1965-)，女，主任醫師，從事不孕癥、圍試管嬰兒期調治、復發性流產、月經不調等疾病的中醫藥防治與研究，Tel:13488936756，E-mail:zqan999d@126．com。