槲皮素對高糖誘導腎小球系膜細胞增殖及TGF-β1/ Smads信號通路的影響*

吳素珍，李加林，陳水親△

(1．贛南醫學院生物化學與分子生物學教研室，江西贛州 341000; 2．贛南醫學院天然藥物化學教研室，江西贛州 341000)

槲皮素對高糖誘導腎小球系膜細胞增殖及TGF-β1/ Smads信號通路的影響*

吳素珍1，李加林2，陳水親1△

(1．贛南醫學院生物化學與分子生物學教研室，江西贛州 341000; 2．贛南醫學院天然藥物化學教研室，江西贛州 341000)

目的:研究槲皮素在高糖環境下對大鼠腎小球系膜細胞增殖槲皮素對照組及TGF-β1表達的影響。方法:將體外培養的大鼠系膜細胞分為正常組、高糖組、槲皮素對照組及槲皮素低、中、高劑量組6組，MTT法檢測槲皮素對腎小球系膜細胞增殖的影響，Western-blot法檢測腎小球系膜細胞TGF-β1、P-Smad2、FN的表達。結果:槲皮素能夠顯著抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖及TGF-β1、P-Smad2、FN表達。結論:槲皮素可通過降低TGF-β1水平抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖，并通過抑制Smad2磷酸化部分影響TGF-β1/Smads信號通路的激活，降低FN的表達，對腎臟起到保護作用。

槲皮素;腎小球系膜細胞;轉化生長因子-β1;纖連蛋白

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的主要病理學表現為腎臟體積增大，腎小球基底膜增厚，系膜細胞增生、肥大及系膜區細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，特別是纖連蛋白(fibronectin，FN)進行性積聚，并逐步發展為腎小球硬化。系膜細胞是腎小球固有細胞的一種，在維持腎小球的正常結構和功能方面發揮著重要作用，同時不可避免地參與DN的發病過程［1］。大量研究證實，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在糖尿病腎病中發揮著重要作用，是引起腎小球硬化的主要細胞因子，因此TGF-β1及其信號傳導通路成為研究各種原因所致腎臟病變的重要靶點［2］。槲皮素及其衍生物是具有多種活性的黃酮類化合物。近年來研究發現，槲皮素具有抗氧化、抑制腫瘤、抗炎、降血脂等藥理作用。有研究認為，槲皮素對糖尿病腎病(DN)具有保護作用，可延緩糖尿病患者腎小球硬化的進程，減輕腎小球肥大程度及蛋白尿的程度［3］。本實驗通過體外培養的大鼠腎小球系膜細胞，研究槲皮素對高糖條件下腎小球系膜細胞增殖和TGF-β1表達的影響，以及槲皮素對 TGF-β1/ Smads信號通路的影響，探討槲皮素抗糖尿病腎病作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

槲皮素由贛南醫學院天然藥物研究與開發重點實驗室提供(純度大于95%)。胎牛血清(GIBCO公司);DMEM培養基(GIBCO公司);噻唑藍(MTT，Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司); CO2培養箱(Thermo公司);MK3酶標儀(Thermo公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司);小鼠抗大鼠β-Actin抗體(1∶1000，Santa Cruz)、小鼠抗大鼠TGF-β1抗體 (1∶1000，Santa Cruz);兔抗大鼠pSmad2抗體(1∶1000，Cell signaling)、小鼠抗大鼠FN抗體(1∶10000，BD Biosciences);辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶10000，Santa Cruz)、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠 IgG(1∶10000，Santa Cruz);顯影液、定影液(谷歌生物科技有限公司)，ECL發光液(Thermo公司)，其他化學試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SD大鼠(購于武漢大學動物實驗中心，合格證號SCXK鄂2008-0004)腎小球原代系膜細胞置于含20%胎牛血清的DMEM培養液中，置于飽和濕度、37℃、5%CO2條件下培養箱內靜置培養，2～3 d換1次液，細胞生長迅速，3～4 d傳1次代。本實驗采用5～15代系膜細胞。

1.2.2 MTT法檢測槲皮素對高糖刺激系膜細胞增殖的影響 取對數生長期的系膜細胞配成濃度1.0×105/mL的細胞懸液，以每孔接種細胞懸液180 μL接種于96孔培養板，在37℃、5%CO2條件下培養24 h后，實驗分為正常組(NC組，5.5 mmol/ L葡萄糖)、槲皮素對照組(5.5 mmol/L葡萄糖+50 μmol/L槲皮素)、高糖組(HG組，30 mmol/L葡萄糖)、槲皮素低劑量組(LQ組，30 mmol/L葡萄糖+ 25 μmol/L槲皮素)、槲皮素中劑量組(MQ組，50 mmol/L葡萄糖+50 μmol/l槲皮素)和槲皮素高劑量組(HQ組，100 mmol/l葡萄糖+100 μmol/L槲皮素)6組。每組設6個平行孔，繼續培養48 h后，每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)溶液，再培養4 h。小心棄去培養液，每孔加入150 μL DMSO溶液，待完全溶解后，于酶標儀570 nm波長處測定各孔吸光度。

1.2.3 Western Blot方法檢測細胞中TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達 取對數生長期的腎小球系膜細胞，用20%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞濃度1.0×105/mL，每孔2 mL，接種于直徑6 cm細胞培養皿中，置入37℃、5%CO2培養箱培養，細胞80%融合時，換無血清DMEM培養液培養24 h，使細胞生長同步化，分為正常對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、槲皮素對照組(5.5 mmol/L葡萄糖 +50 μmol/L槲皮素)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖)、槲皮素低劑量組(30 mmol/L葡萄糖+25 μmol/L槲皮素)、槲皮素中劑量組(30 mmol/L葡萄糖 +50 μmol/L槲皮素)，培養48 h后收集細胞，加入細胞裂解液后于冰上裂解15 min，離心半徑8 cm，12000 r/min，4℃離心10 min收集上清。采用SDS-PAGE分離樣品中的蛋白成分，各泳道蛋白上樣量為50 μg。再將凝膠上的蛋白轉印到0.45 μm硝酸纖維素膜(NC膜)上，NC膜用脫脂奶粉進行封閉，然后與一抗孵育4℃過夜，TBST洗滌后再與過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，TBST再次洗滌，電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)檢測免疫印跡信號，以X-膠片記錄實驗結果，用灰度值表示蛋白表達量。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，所有數據以均數±標準差(±s)表示，多個樣本均數與對照組樣本均數之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槲皮素對高糖環境下大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響

表1顯示，高糖組腎小球系膜細胞的OD值比正常組顯著增大(P＜0.01)，表明高糖誘導系膜細胞的增殖。槲皮素不同濃度組系膜細胞OD值與高糖組比較均有顯著降低 (P＜0.01)，槲皮素中劑量組的系膜細胞OD值比低劑量組的系膜細胞OD值顯著降低(P＜0.05)，高劑量組的系膜細胞OD值比槲皮素中劑量組低，但差異無統計學意義(P＞0.05)，槲皮素可明顯抑制體外高糖環境下系膜細胞的增殖。

表1 槲皮素對系膜細胞增殖的影響(±s)

表1 槲皮素對系膜細胞增殖的影響(±s)

注:與正常組比較:1)P＜0.01;與高糖組比較:2)P＜0.01;與槲皮素中劑量組比較:3)P＜0.05

組別 例數 OD值正 常 組60.7200±0.046槲 皮 素 對 照 組 6 0.7832±0.081高 糖 組 6 1.3433±0.1401)槲皮素低劑量組 6 1.0317±0.1082)3)槲皮素中劑量組 6 0.9067±0.0912)槲皮素高劑量組 6 0.8833±0.0702)

2.2 槲皮素對高糖環境下TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達的影響

表2圖1顯示，與正常組比較，高糖組TGF-β1蛋白表達量顯著增加(P＜0.01)，而槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組系膜細胞的TGF-β1蛋白和高糖組比較，表達量顯著減少(P＜0.01)。與正常組比較，高糖組P-Smad2蛋白表達量顯著增加(P＜0.01)。而槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組系膜細胞的P-Smad2蛋白和高糖組比較，表達量顯著減少(P＜0.01)，且隨槲皮素濃度的增加，P-Smad2蛋白的表達量降低。與正常組比較，高糖組FN蛋白表達量顯著增加(P＜0.01)。而槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組系膜細胞的FN蛋白和高糖組比較，表達量顯著降低(P＜0.01)。槲皮素對照組和正常對照比較，系膜細胞TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達比較差異無統計學意義。

3 討論

糖尿病腎病的發生率在糖尿病病程20年后可達到30%～40%，其中有5%～10%的患者會惡化成終末期腎病，只有進行血液透析或腎移植才能維持、挽救生命［4］。糖尿病腎病的主要病理特征是腎小球硬化，足細胞損傷，腎小球系膜細胞肥大［5-7］，并大量表達細胞外基質蛋白(extra cellular matrix，ECM)，主要包括膠原蛋白(Collagen)、纖連蛋白(fibronectin，FN)和層黏連蛋白(laminin，LN)，這些蛋白分泌到系膜細胞外并沉積在腎小球內導致腎小球硬化［8-10］。因此，研究系膜細胞內調控ECM表達的信號通路是防治糖尿病腎臟疾病的核心與焦點。

圖1 槲皮素對TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達的影響

表2 槲皮素對TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白相對表達量的影響(±s)

表2 槲皮素對TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白相對表達量的影響(±s)

注:與正常組比較:1)P＜0.01;與高糖組比較:2)P＜0.01

組別 例數 TGF-β1 P-Smad2 FN正 常 組3 1±0.18 1±0.13 1±0.220槲皮素對照組 3 1.08±0.21 0.97±0.19 1.18±0.280高 糖 組 3 3.11±0.401) 4.06±0.321) 2.1±0.1801)槲皮素低劑量組 3 0.99±0.152) 2.48±0.212)1.41±0.1702)槲皮素中劑量組 3 1.08±0.172) 2.16±0.202) 1.4±0.1822)

TGF-β/smads信號通路是TGF-β下游的一個特別的信號通路，在糖尿病腎病中被激活，導致胞外基質 (extracellularmatrix，ECM)如纖連蛋白(fibronectin，FN)進行性積聚，并逐步發展為腎小球硬化［11］。多數研究表明，高血糖經各種異常代謝途徑產生的產物能誘導TGF-β1蛋白表達增加，TGF-β1直接促進系膜細胞增殖、肥大，激活Smad信號通路，上調系膜細胞外基質蛋白如纖連蛋白(FN)等表達，抑制基質蛋白降解酶合成，從而減少細胞外基質蛋白的降解，最終導致腎小球細胞外基質蛋白過量堆積［12］。本實驗研究發現，大鼠腎小球系膜細胞經30 mmol/L葡萄糖誘導后，細胞增殖明顯，TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達增加，證實高糖可能通過TGF-β1/Smads信號通路促進腎小球硬化。

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，它在蔬菜、水果等綠色植物中分布極廣。槲皮素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集和清除自由基等多種生物活性。近年來研究表明，槲皮素有防治糖尿病腎病的藥理作用［13-14］。徐向進等［15］研究發現，槲皮素能明顯抑制糖尿病腎病大鼠TGF-β1的過度表達。本實驗體外研究發現，槲皮素低、中、高3個劑量組均能顯著抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖(P＜0.01)，但槲皮素中劑量組與槲皮素高劑量組之間比較抑制高糖環境下的系膜細胞增殖差異無統計學意義(P＞0.05)。因此，我們選擇槲皮素低劑量組和槲皮素中劑量組對高糖環境下 TGF-β1、PSmad2、FN蛋白表達的影響。結果提示，槲皮素能抑制高糖環境下腎小球系膜細胞TGF-β1蛋白的過度表達，同時對TGF-β/Smads信號通路中的重要信號分子之一的smad2磷酸化有明顯的抑制作用，部分阻斷TGF-β/Smads信號通路，進而抑制FN的表達，對腎臟起保護作用。槲皮素對照組對系膜細胞的增殖、TGF-β1、P-Smad2、FN蛋白表達和正常組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。綜上所述，可以推斷槲皮素可能部分通過影響糖尿病腎病腎小球系膜細胞TGF-β/Smads的信號通路，最終發揮對糖尿病腎病的防治作用。

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Effects of Quercetin on the Proliferation of Glomerular Mesangial Cells and the Signal Pathway of TGF-β1/Smads Induced by High Glucose

WU Su-zhen1，LI Jia-lin2，CHEN Shui-qin1△
(1．Teaching and Research Section of biochemistry and Molecular Biology，Gannan Medical University，Jiangxi Ganzhou 341000，China;2．Teaching and Research Section of Natural Pharmaceutical chemistry，Gannan Medical University，Jiangxi，Ganzhou 341000，China)

Objective To investigate the effect of quercetin on the proliferation and expression of TGF-β1 of mesangial cell cultured in high glucose condition．Method:Glomerular mesangial cells were divided into six groups:normal group，quercetin control group，high glucose group，low，medium and high doses of quercetin group．MTT colorimetric method was used to study the influence of quercetin on proliferation of glomerular mesangial cell．Western-blot was used to detect the express of TGF-β1 in glomerular mesangial cell．Result:Quercetin significantly inhibited the proliferation and expression of TGF-β1 of mesangial cell under the stimulation of high glucose．Conclusion:Quercetin could partially block the activation of P-Smad2 signaling pathway in glomerular mesangial cell，inhibit the expression of FN and proliferation of glomerular mesangial cell．

Quercetin;Mesangial cell;Transforming growth factor-β1; Fibronectin

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0195-03

2015-06-05

江西省教育廳科技計劃項目(GJJ09322)

吳素珍，講師，醫學碩士，從事中藥抗糖尿病腎病的臨床與研究。

△通訊作者:陳水親，Tel:18970786182，E-mail:940479353@ qq．com。