他克莫司處理的未成熟樹突狀細胞對小鼠炎癥性腸病的作用及其機制研究

魏丹蕓　　張　洪　　彭　銳　　張　英武漢大學人民醫院藥學部，湖北武漢　430060

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他克莫司處理的未成熟樹突狀細胞對小鼠炎癥性腸病的作用及其機制研究

魏丹蕓張洪彭銳張英
武漢大學人民醫院藥學部，湖北武漢430060

[摘要]目的探討他克莫司（Tac）處理的未成熟樹突狀細胞（imDC）對小鼠克羅恩病模型中炎性腸病的作用及其具體的機制。方法體外培養小鼠骨髓來源的樹突狀細胞（DC），加入Tac處理抑制其成熟，以2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸法制作克羅恩病模型。將48只小鼠隨機分為4組，分別為對照組、模型組、imDC組、Tac-imDC組，每組各12只。對照組給予50%乙醇溶液灌腸，其余三組分別給予TNBS灌腸造模，各組在灌腸前24 h和灌腸后24 h分別經尾靜脈輸注相應的PBS或者imDC，對照組和模型組經尾靜脈輸注PBS，imDC組輸注1×106個未經Tac處理過的imDC，Tac-imDC組輸注1×106個經過Tac處理過的imDC。每天記錄小鼠一般情況，7 d后分別行疾病活動指數（DAI）、結腸大體形態損傷指數（CMDI）和結腸病理組織學（TDI）評分，取小鼠結腸組織行酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測白介素-10（IL-10）、轉化生子因子-β（TGF-β）和白介素-17（IL-17）的水平變化。結果相比于對照組，模型組的DAI、CMDI和TDI評分明顯升高[DAI：（0.75±0.10）比（5.12±1.05）分；CMDI：（0.70± 0.12）比（6.52±1.18）分；TDI：（0.34±0.03）比（5.53±1.12）分；均P＜0.01]，TGF-β、IL-10水平明顯下降[TGF-β：（20.421±2.091）比（14.356±1.756）pg/mL；IL-10：（6.162±0.512）比（4.012±0.469）pg/m；均P＜0.01]，IL-17水平明顯升高[（19.232±2.187）比（25.754±3.621）pg/mL，P＜0.01]。相對于模型組，imDC組和Tac-imDC組的DAI、CMDI和TDI評分均顯著下降[DAI：（5.12±1.05）比（4.01±0.92）、（3.12±0.81）分；CMDI：（6.52±1.18）比（5.04±1.05）、（3.54± 0.98）分；TDI（5.53±1.12）比（4.00±0.88）、（3.22±0.92）分；P＜0.05或P＜0.01]，而TGF-β、IL-10水平上升[TGF-β：（14.356±1.756）比（16.012±2.012）、（19.002±2.756）pg/mL；IL-10：（4.012±0.469）比（4.956±0.534）、（5.618±0.595）pg/mL；P＜0.05或P＜0.01]，IL-17水平明顯下降[（25.754±3.621）比（22.741±3.051）、（20.319±2.654）pg/mL，P＜0.05或P＜0.01]。相對于imDC組，Tac-imDC組的變化更為顯著[DAI：（4.01±0.92）比（3.12±0.81）分；CMDI：（5.04±1.05）比（3.54±0.98）分；TDI：（4.00±0.88）比（3.22±0.92）分；TGF-β：（22.741±3.051）比（20.319±2.654）pg/mL；IL-17：（16.012± 2.012）比（19.002±2.756）pg/mL；IL-10：（4.956±0.534）比（5.618±0.595）pg/mL；P＜0.05或P＜0.01]。結論未成熟的樹突狀細胞能明顯緩解小鼠克羅恩病模型中小鼠炎癥性腸病，而經過Tac處理的未成熟樹突狀細胞更能加強其抑制炎癥的作用，其機制可能是介導了Th17/Treg軸的偏倚。

[關鍵詞]他克莫司；樹突狀細胞；小鼠炎癥性腸病；克羅恩病模型

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）作為體內最重要的抗原提呈細胞，不僅直接參與機體對外來抗原的免疫反應，而且在誘導免疫耐受中也起著十分重要的作用，其誘導免疫耐受的機制可能是在未成熟的DC （immaturate dendritic cell，imDC）表面低表達主要組織相容性抗原-Ⅱ（MHC-Ⅱ）和共同刺激因子CD80、CD86，缺失這些表面因子后其抗原提呈能力減弱，無法提供幼稚T細胞向效應T細胞轉化的第二信號[1]。傳統觀點認為小鼠克羅恩病模型主要是以輔助性T細胞1（T helper 1 cell，Th1）過度活化為主的免疫失調引起的疾病[2]，但是近來發現輔助性T細胞17（T helper 17 cel，Th17）/調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）軸的失衡在疾病發生和發展方面也起著重要的作用[3]。Tac作為新一代的新型免疫抑制劑，能全面抑制T淋巴細胞的的作用，較環孢素強100倍，在潰瘍性結腸炎的治療中已經初見其效[4]。本實驗通過體外培養小鼠骨髓來源的imDC，在培養過程中經過Tac

處理，檢測其成熟程度，研究其在緩解小鼠炎癥性腸病模型中的作用及其機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與試劑

1.1.1動物6～8周齡SPF級雌性bal/c小鼠48只，體重18～22 g，購于武漢大學動物實驗中心[許可證號：SCXK（鄂）2014-0004]，飼養于武漢市三醫院動物實驗中心。

1.1.2試劑胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份公司；重組小鼠白細胞介素4（rm IL-4）和重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）購于Peprotech公司；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）購于Sigma公司；三氫-吲哚菁型染料（PE-Cy7）標記的抗鼠CD11c抗體，藻紅蛋白（PE）標記的抗小鼠CD80、CD86、MHC-Ⅱ以及同型對照抗體均購于美國BD公司；白介素-10 （IL-10）、白介素-17（IL-17）、TGF-β酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購于R&D公司。

1.2小鼠imDC的體外培養和鑒定

1.2.1小鼠骨髓源imDC的獲取和培養參考O'Flynn 等[5]的方法，取小鼠完整的股骨和脛骨，離斷干骺端后，用1mL注射器針頭抽吸PMRI 1640培養基沖洗骨髓，經過濾后加入紅細胞裂解液后離心以含10%的胎牛血清PMRI 1640培養基重懸細胞，調整密度為1×106個/mL，分布于六孔板中，培養于37℃5%CO2培養箱中孵育，培養4 h后去除含淋巴細胞的懸液，重新加入新鮮的10%胎牛血清PMRI 1640完全培養基，并添加細胞因子rm IL-4（5 ng/mL）和rmGM-CSF（10 ng/mL）。隔天半量換液，重新加入含細胞因子的新鮮培養基，第6天收獲未成熟的DC，而Tac處理的DC則在開始培養DC時加入，濃度為10 ng/mL，換液時加入同樣劑量的Tac。

1.2.2imDC的鑒定分別收集兩組不同培養方法的DC，離心重懸，在細胞密度為1×106個/mL 100μL的反應體系中分別加入抗小鼠的PE-Cy7-CD11c，PECD80，PE-CD86，PE-MHC-Ⅱ5μL，同時設同型對照，避光孵育半小時后以PBS洗滌兩遍，后加入4%多聚甲醛固定后上流式細胞儀檢測。

1.3實驗分組、模型建立及細胞輸注

1.3.1分組將48只小鼠隨機分為4組，每組12只，第1組為對照組，以50%乙醇灌腸前后1 d各經尾靜脈輸注PBS，第2組為模型組，以TNBS灌腸前后24 h各經尾靜脈輸注PBS，第3組為imDC組，在TNBS灌腸前后24 h各經尾靜脈輸注1×106個未經Tac處理的imDC。第4組為Tac-imDC組，在TNBS灌腸前后24 h各經尾靜脈輸注1×106個經過Tac處理過的imDC。

1.3.2小鼠克羅恩病模型的建立按照Eeckhaut等[6]方法，小鼠適應性飼養1周后給予禁食不禁水24 h，模型組、imDC組、Tac-imDC組經腹腔注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉后，倒懸位，將直徑為0.2mm的聚乙烯管插入肛門約5 cm，緩慢灌入TNBS/50%乙醇混合溶液0.1 mL（1體積TNBS水溶液與1體積無水乙醇混勻），而對照組給予灌入等劑量50%乙醇，拔管后繼續保持倒立約1min，放回籠中正常飼養。

1.3.3經尾靜脈輸注藥物在灌腸前24 h和灌腸后24 h經尾靜脈輸注相應的藥物，對照組和模型組輸注PBS，imDC組輸注未經Tac處理過的imDC，Tac-imDC組輸注經Tac處理過的imDC。

1.4觀察指標與評價方法

1.4.1小鼠疾病活動指數（DAI）觀察及評分根據相關標準[7]行小鼠DAI評分，觀察小鼠的精神狀態，大便的性質，有無血便，每天記錄小鼠的的體重變化情況。0分：大便性質正常，無血便及隱血便，體重無下降；1分：大便松散，隱血便陽性弱陽性，體重下降＞0～5%；2分：大便松散，隱血陽性，體重下降＞5%～10%；3分：呈稀便，肉眼血便，體重下降＞10%～15%；4分：呈稀便，大量肉眼血便，體重下降＞15%。DAI評分=大便性質評分+血便評分+體重變化評分。

1.4.2小鼠結腸大體形態損傷指數（CMDI）觀察及評分造模后第7天處死小鼠后，取全段結腸組織在解剖顯微鏡下觀察潰瘍及炎癥情況，根據Wallace等[8]標準進行評分：0分：基本正常；1分：無潰瘍，局部可見充血；2分：可見潰瘍，但無充血；3分：僅1處潰瘍和炎癥；4分：2處或更多處的潰瘍和炎癥；5分：潰瘍長于2 cm；6～10分：大于2 cm的潰瘍，每增加1 cm 加1分，有輕度粘連時（結腸較易與周圍組織剝離）加1分，粘連較嚴重時加2分，

1.4.3小鼠結腸病理組織學指數（TDI）觀察及評分在解剖顯微鏡下取病變較嚴重處，用4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋，切片和HE染色，根據Dieleman等[9]標準如下：炎癥細胞浸潤：無為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分；浸潤深度無為0分，黏膜層為1分，黏膜下層及肌層為2分，結腸全層為3分；潰瘍深度：無為0分，上皮層為1分，黏膜層為2分，黏膜肌層為3分。DAI評分=炎癥細胞浸潤程度+浸潤深度+潰瘍深度評分。

1.4.4ELISA法測定小鼠結腸組織TH17/Treg相關細胞因子IL-17和TGF-β、IL-10的水平變化將結腸組織放在冰的PBS上沖洗，濾紙拭干后稱取約10 mg結腸組織，加入1 mL PBS（pH：6.0，內含1μg抑肽酶和亮肽素胃酶抑素A），用眼科剪剪碎后放入勻漿器進行勻漿，4℃，12 000 r/min離心20min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測IL-17和TGF-β、IL-10的濃度。

1.5統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1imDC的鑒定

2.1.1形態學觀察培養4 h可見大量的圓形貼壁細胞，均勻分布，見圖1；2 d后有大量的集落形成，開始有微小發絲樣突起產生，見圖2；5 d后細胞逐漸從集落脫離，呈典型的樹突狀形態，見圖3；第7天imDC呈毛刺樣突起，見圖4。

圖1　倒置顯微鏡下觀察培養4 h的樹突狀細胞形態（2 0 0×）

圖2　倒置顯微鏡下觀察培養2 d的樹突狀細胞形態（2 0 0×）

圖3　倒置顯微鏡下觀察培養5 d的樹突狀細胞形態（4 0 0×）

圖4　倒置顯微鏡下觀察培養第7天樹突狀細胞的形態（4 0 0×）

2.1.2細胞表面標志物的流式細胞儀檢查測得細胞表面表達DC的特異性表面標志物CD11c的表達率為85%，未經Tac處理過的DC表達共同刺激因子CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達率分別為31.6%、25.4%和51.0%，而經過Tac處理過的DC表達共同刺激因子CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達率分別為15.5%、10.3%和31、7%，符合imDC的表型，與Gao等[10]結果一致。見圖5。

2.2實驗小鼠指標的評價

根據上述“1.4”項下所描述的方法和標準對每組小鼠進行評分并記錄，相比于對照組，模型組的DAI、CMDI、TDI評分明顯升高，差異均有高度統計學意義（P＜0.01）。相比于模型組，imDC組和Tac-imDC組的DAI、CMDI、TDI評分明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。相比于imDC組，Tac-imDC組上訴評分降低更加明顯，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

2.3小鼠結腸組織相關因子的檢測

相比于對照組，模型組的小鼠結腸組織細胞因子IL-17水平明顯升高，而細胞因子TGF-β和IL-10水平明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。相比于模型組，imDC組和Tac-imDC組的IL-17水平明顯降低，而TGF-β和IL-10水平明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。相比于imDC組，Tac-imDC組的IL-17、TGF-β、IL-10水平降低的更為顯著，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

imDC：未成熟樹突狀細胞；Tac-imDC：經過他克莫司處理過的imDC圖5　未經T a c處理后和經過T a c處理后的i m DC的表型

3　討論

DC作為機體內最重要的專職抗原提呈細胞，決定著機體是產生免疫耐受還是免疫反應，其表面的共同刺激分子CD80和CD86能夠與T細胞表面的共同刺激分子細胞毒性T細胞相關蛋白-4（CTL-4）特異性結合來激活下游信號，從而使幼稚T細胞向效應T細胞轉化，導致免疫的激活[11]。DC表面的另外的表面分子MHC-Ⅱ起著識別抗原的作用，與抗原結合后將抗原信息提供給T細胞，誘導免疫反應[12]，目前達成共識的是未成熟的DC缺乏共同刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ，從而誘導T細胞的失能，導致免疫耐受，而成熟的DC高表達上述分子，提供T細胞活化的信號，從而導致免疫的激活[13]。

表1　各實驗組考察指標項評分（分，±s）

表1　各實驗組考察指標項評分（分，±s）

注：對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；##P＜0.01；與imDC組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；DAI：疾病活動指數評分；CMDI：結腸大體形態損傷指數評分；TDI：結腸病理組織學評分；imDC：未成熟樹突狀細胞；Tac-imDC：經過他克莫司處理過的imDC

組別　　例數　DAI　CMDI　TDI對照組模型組imDC組Tac-imDC組12 12 12 12 0.75±0.10 5.12±1.05*4.01±0.92#3.12±0.81##▲0.70±0.12 6.52±1.18*5.04±1.05##3.54±0.98##▲▲0.34±0.03 5.53±1.12*4.00±0.88##3.22±0.92##▲

表2　各組小鼠結腸組織I L-1 7和I L-1 0、TGF-β細胞因子含量（pg/mL，±s）

表2　各組小鼠結腸組織I L-1 7和I L-1 0、TGF-β細胞因子含量（pg/mL，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與imDC組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；IL-17：白介素-17；TGF-β：轉化生子因子β；IL-10：白介素-10；imDC：未成熟樹突狀細胞；Tac-imDC：經過他克莫司處理過的imDC

組別　　例數　IL-17　TGF-β　IL-10對照組模型組imDC組Tac-imDC組12 12 12 12 19.232±2.187 25.754±3.621*22.741±3.051#20.319±2.654##▲20.421±2.091 14.356±1.756*16.012±2.012#19.002±2.756##▲▲6.162±0.512 4.012±0.469*4.956±0.534##5.618±0.595##▲▲

幼稚T細胞在激活后分化為不同的效應T細胞，分為Th1、Th2、Th17、Treg細胞[14]，傳統觀點認為，克羅恩病的主要致病機制為Th1細胞的過度活化和數量增多，分泌炎癥因子γ干擾素，導致免疫紊亂。但后來一系列實驗發現Th17和Treg細胞軸的偏倚也是導致克羅恩病的重要發病機制[15-17]。Th17以分泌IL-17而命名，IL-17具有強大的募集和激活中性粒細胞的能力，能誘導激活T細胞和刺激成纖維細胞、巨噬細胞和上皮細胞產生多種促炎物質，引起局部炎癥細胞的浸潤，組織的破壞[18]，而Treg分泌的細胞因子IL-10 和TGF-β，IL-10不僅僅能抑制T細胞的增值，而且還能抑制其他免疫細胞，如自然殺傷細胞、巨噬細胞和單核細胞的活化，而TGF-β對于T細胞、B細胞、巨噬細胞和其他免疫性細胞也起著抑制其增值、分化的作用[19]。在以往的實驗中，通過尾靜脈輸注未成熟的DC，雖然在一定程度上減輕了炎性反應，但還是無法完全消除炎性反應，原因可能是在體外未成熟的DC在輸入小鼠體內后，在復雜的微環境中特別是在炎癥緩解下會轉化為成熟的DC，甚至有可能加重炎性反應[20]。

筆者發現，通過Tac處理過的imDC，其表面共同刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ表達的量較未經Tac處理過的imDC更低，將經Tac處理過的imDC輸入小鼠體內后發現，相對于未成熟組，其克羅恩病的疾病指數較未經Tac處理組明顯降低，說明在未成熟的DC經Tac處理后在小鼠體內更能保持未成熟的狀態。為了進一步探討其imDC誘導耐受機制，本實驗采用ELISA法檢測了結腸組織Th17/Treg相關細胞因子，發現Tac處理組其Th17相關因子IL-17明顯低于未經Tac處理組和模型組，而經Tac處理組其Treg相關因子IL-10和TGF-β明顯高于未經Tac處理組和模型組，說明經Tac處理的imDC能使體內Th17相關因子IL-17處于較低水平，使Treg相關因子IL-10 和TGF-β處于較高水平，可能imDC介導了體內Th17/ Treg免疫偏倚，并且經過Tac處理過的imDC加強了這種偏倚，從而使免疫反應更加減輕了。

本實驗成功制作出克羅恩病模型，并通過實驗證明經過Tac處理的imDC更能加強其抑制炎癥的作用。其機制可能介導了TH17/Treg軸的偏倚，從而揭示了經Tac處理的imDC抑制克羅恩病小鼠模型炎癥進展的分子基礎，這為如何保持imDC穩定狀態從而更加安全地減輕克羅恩病炎癥進程提供了實驗數據，也為其在臨床中的應用提供了新的方法。

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Research of the function and mechanism of Tacrolimus-treated dendritic cells on mouse inflammatory bowel disease

WEIDanyun ZHANG Hong PEN Rui ZHANG Ying
Department of Pharmacy,Renmin Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

[Abstract]Objective To investigate the effect of Tacrolimus-treated immture dendritic cells(imDC)on the Crohn's micemodels induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)and the actionmachnasim.M ethods Dendritic cells were obtained from the murine bone marrow and treated with Tac to maintain its immature,and Crohn's mice models were induced by TNBS.48 mice were randomly divided into four groups:control group,model group,imDC group and Tac-imDC group,evey group contains 12 mice.The other three groups were iuduced to Crohn'smodels by instillation of the 50%ethanol/TNBS enema.And the control group was instilled 50%ethanol enema.24 hours before and after instill enema,PBS or cells was injected via tail vein.Control group and model group were injected PBS;the imDC group were injected DC that did not treated by Tac;the Tac-imDC group were injected imDC that treated by Tac.Then the general situation ofmice were observed.After one week,the disease activity indexbook=26,ebook=29(DAI),colon macroscopic damage index(CMDI)and tissue damage index(TDI)were evaluated;the colon levels of interleukin-17(IL-17),interleukin-10(IL-10),transforming growth factor-β(TGF-β)were determined by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).Results Compared with the control group,scores of DAI,CMD an TDI inmodel group were significantly increased[DAI:(0.75±0.10)vs(5.12±1.05)scores,CMDI:(0.70±0.12)vs(6.52±1.18)scores; TDI:(0.34±0.03)vs(5.53±1.12)scores;all P＜0.01].And the colon tissue levels of IL-10,TGF-βwere significantly decresed[TGF-β:(20.421±2.091)vs(14.356±1.756)pg/mL;IL-10:(6.162±0.512)vs(4.012±0.469)pg/mL;all P＜0.01].But the level of IL-17 was significantly increased[(19.232±2.187)vs(25.754±3.621)pg/mL,P＜0.01].Compared with model group,the scores of DAI,CMDI,TDI in imDC and Tac-imDC group were significantly decreased [DAI:(5.12±1.05)vs(4.01±0.92),(3.12±0.81)scores;CMDI:(6.52±1.18)vs(5.04±1.05),(3.54±0.98)scores;TDI: (5.53±1.12)vs(4.00±0.88),(3.22±0.92)scores,P＜0.05 or P＜0.01].The colon levels of IL-10,TGF-βin imDC group and Tac-imDC group were incresed significantly[TGF-β:(14.356±1.756)vs(16.012±2.012),(19.002±2.756)pg/mL, IL-10:(4.012±0.469)vs(4.956±0.534),(5.618±0.595)pg/mL,P＜0.05 or P＜0.01],and the level of IL-17 was decresed significantly[(25.754±3.621)vs(22.741±3.051),(20.319±2.654)pg/mL,P＜0.05 or P＜0.01].Butwhen compared with imDC group,the changes were more significantly[DAI:(4.01±0.92)vs(3.12±0.81)scores;CMDI:(5.04±1.05)vs (3.54±0.98)scores;TDI:(4.00±0.88)vs(3.22±0.92)scores;TGF-β:(22.741±3.051)vs(20.319±2.654)pg/mL;IL-17: (16.012±2.012)vs(19.002±2.756)pg/mL;IL-10:(4.956±0.534)vs(5.618±0.595)pg/mL;P＜0.05 or P＜0.01].Conclusion ImDC can significantly attenuates intestinal inflammation in Crohn'smicemodels and the effection can be enhanced by Tac.Themechanism may be involved in the shiftof Th17/Treg axis.

[Key words]Tacrolimus;Dendritic cells;Inflammatory bowel disease;Crohn'smicemodels

收稿日期：（2015-08-12本文編輯：任念）

[通訊作者]張洪（1962.5-），男，教授，碩士生導師；研究方向：消化系統疾病治療藥物的藥劑學與藥理學研究。

[作者簡介]魏丹蕓（1990.4-），女，碩士；研究方向：個體化給藥。

[中圖分類號]R574

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-7210（2016）01（a）-0025-06