肝硬克顆粒中丹酚酸B的含量測定

王如意　　黃百祺　　林素蘭.廣東食品藥品職業(yè)學院實驗實訓中心，廣東廣州　5050；.廣東科貿(mào)職業(yè)學院生物技術系，廣東廣州　50430

?

肝硬克顆粒中丹酚酸B的含量測定

王如意1黃百祺2林素蘭1
1.廣東食品藥品職業(yè)學院實驗實訓中心，廣東廣州510520；2.廣東科貿(mào)職業(yè)學院生物技術系，廣東廣州510430

[摘要]目的探討用高效液相色譜法測定肝硬克顆粒中丹酚酸B的含量。方法采用島津C18色譜柱（Diamonsil（鉆石）C18，250mm×4.6mm，5μm），柱溫：30℃，檢測波長：286 nm；流動相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）。結果丹酚酸B的線性范圍為19.8～99.0μg/mL，回歸方程為Y=14328C-6710.3（r=0.9998）；平均回收率為96.85%，RSD為0.77%。結論本法結果準確，專屬性強，操作簡便，成本低，適合于肝硬克顆粒中丹酚酸B含量的測定。[關鍵詞]丹酚酸B曰肝硬克顆粒曰高效液相色譜法曰含量測定

肝硬克顆粒是由丹參、黃芪等多味中藥經(jīng)不同溶劑提取成浸膏，加以輔料混合而制成的復方制劑，具有清熱解毒、活血化瘀、軟堅散結之功效，用于慢性乙型肝炎，防治肝炎后肝纖維化及早期肝硬化。丹參為本方中的君藥，生產(chǎn)時以水作為溶媒，低溫下超聲提取2次，濾液減壓濃縮得到濕浸膏，主要含脂溶性的二萜醌類和水溶性的酚酸類，這兩類成分均為丹參的有效成分[1]。酚酸類成分包括丹酚酸A，丹酚酸B，丹酚酸C等。其中丹酚酸B是含量最高的活性成分。文獻記載表明[2-8]，丹酚酸B具有抗凝、抗氧化等活性，具有抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化和改善記憶功能障礙等作用。

丹酚酸B（salvianolic acid B），也叫丹參酚酸B、丹參酸乙等。藥理研究和文獻記載表明[17-22]，丹酚酸B具有抗凝、抗氧化的活性，具有抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化和改善記憶功能障礙等作用。丹酚酸B可能通過下調肝組織轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達抑制膠原的合成，同時下調TIMP-2表達而使膠原分解加強，從而減輕肝纖維化的程度，對肝纖維化的形成有明顯的抑制作用，并推測丹酚酸B抗肝纖維化的部分機制在于抑制了活化貯脂細胞的增殖，并通過抑制貯脂細胞生成細胞外基質而減少了膠原纖維在肝內的沉積，以及干擾了狄氏間隙基底膜的形成而減輕了肝竇毛細胞血管化等，改善纖維化肝臟的脂質過氧化損傷并降低肝組織MMP-2活性是丹酚酸B鹽預防肝纖維化的重要作用機制。

肝硬克顆粒在申報時，君藥丹參只驗證了其脂溶性主要活性成分丹參酮ⅡA的含量測定方法，而丹酚酸B的含量檢測對于藥物質量控制非常重要。鑒于丹酚酸B的重要性，以及各個藥物制劑中的生產(chǎn)工藝、制劑處方均不一樣，各藥劑的分析方法需經(jīng)過驗證，證明采用的方法適合于相應的檢測要求是必要的。

1　儀器與試藥

1.1儀器設備

UV-240型紫外可見分光光度計（日本島津公司），LC10AT高效液相色譜儀（日本島津公司），SPDIOAVP紫外可見檢測器（浙大N2000色譜工作站），AUY220電子天平（日本島津公司）等。

1.2試藥與藥品

丹酚酸B對照品（購自中國食品藥品檢定研究院；批號：111562-201212），肝硬克顆粒（深圳同安藥業(yè)公司生產(chǎn)；批號：131101、131102、131103、小試1.131201、小試2.131202、小試3.131203）。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純，

2　色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

2.1檢測波長的選擇

以水為空白溶液，取丹酚酸B對照品溶液（50μg/mL），在200～400 nm的波長范圍內進行紫外掃描，丹酚酸B在204 nm和286 nm處有最大吸收，考慮204 nm處于近紫外區(qū)的末端，末端干擾較大，故選擇286 nm為檢測波長。

2.2系統(tǒng)使用性試驗

色譜柱以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）為流動相；流速1.0 mL/min；檢測波長為286 nm；柱溫30℃；進樣量20μL。在此色譜條件下丹酚酸B的分離度為1.85。

3　方法與結果

3.1對照品溶液的制備

取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加水制成每毫升含60μg的溶液，即得。

3.2供試品提取方法的選擇

文獻表明，丹參生藥中丹酚酸B的提取以70%甲醇的提取率最高，其次是70%乙醇，水的提取率相對較低。但是3種提取溶劑差異并不是特別顯著，水的提取率也為70%甲醇的95.06%，加上水的成本低，又不造成環(huán)境污染[9]。且考慮到丹酚酸B對熱不穩(wěn)定，其丹參水提液在長時間受熱中，丹酚酸B的含量大大降低[10]。故采用冰浴超聲法對樣品進行前處理。

取同批供試品0.6 g，精密稱定，置50mL量瓶中，加30mL溶劑，超聲處理，放冷，加溶劑至刻度，搖勻，離心，取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。（溶劑分別為70%甲醇和水，超聲時間分別為15、30、45 min，冰浴保溫），結果如表1所示。結果表明，用70%甲醇和純水超聲提取30 min后測得的含量相等，故樣品處理采用純水超聲提取30min。

3.3專屬性試驗

按處方中藥味比例組成，取除丹參外的其余藥材，按制備工藝要求制成不含丹參的陰性樣品，再按”3.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項下色譜條件測定，結果在供試品的色譜圖（圖1C）中，在與對照品色譜峰（圖1A）相應位置上，有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照溶液的色譜圖在此保留時間處未見明顯的色譜峰（圖1B），故認為無干擾。見圖1。

溶劑種類　　超聲時間（min）　　丹酚酸B含量Cx（mg/g）70%甲醇純水15 30 45 15 30 45 5.04 5.33 5.31 5.13 5.33 5.24

3.4線性關系考察

精密稱取丹酚酸B對照品4.95mg，加水制成濃度為99.0μg/mL的丹酚酸B對照溶液。精密量取上述對照品溶液加水制成濃度分別為19.8、39.6、59.4、79.2、99.0μg/mL的丹酚酸B對照溶液，分別精密吸取上述系列溶液各20μL進樣測量，按“2.2”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，丹酚酸B量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，得標準曲線為Y=14328X-6710.3，r=0.9998，表明丹酚酸B在19.8～99μg/mL濃度范圍內與峰面積值有良好的線性關系。

3.5精密度試驗

取同一批樣品，按“3.2”項下方法制成供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液，在“2.2”項下的色譜條件下進樣20μL，重復進樣6次，記錄色譜圖的峰面積，計算RSD為0.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.6穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h吸取20μL進樣考察，按“2.2”項下色譜法測定丹酚酸B的峰面積，計算RSD為1.21%，表明供試品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

3.7重復性試驗

精密稱取供試品3份，按“3.2”項下方法操作，在“2.2”項下色譜條件下進行分析測定，計算丹酚酸B 的RSD為1.65%，結果表明該方法重復性良好。

3.8加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：131102）適量，精密稱取0.3 g，共6份，置50 mL量瓶中，分別精密加入丹酚酸B對照品溶液25mL，超聲處理30min，放冷，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，離心，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，按“2.2”項下色譜條件測定，采用外標法求出丹酚酸B的含量，計算回收率，結果表明本實驗確定的丹酚酸B含量測定方法的準確度較好。見表2。

圖1　丹酚酸B對照品、陰性樣品、樣品色譜圖

表2　丹酚酸B回收率測定結果

3.9樣品含量測定

按“3.2”項下方法制備供試液，測定3批成品和3批小試樣品中丹酚酸B的含量，每樣平行測定3次，實驗表明，與肝硬克顆粒成品相比，小試樣品的丹酚酸B的含量較高，但丹酚酸B混合較不均勻。見表3。

4　討論

考慮樣品中的丹酚酸B是丹參的水溶性活性成分，故在提取時比較了不同溶劑、不同時間的冰浴超聲、水煮加熱回流的對比試驗。結果表明用70%甲醇比水的提取率要高，但低于用超聲法處理的提取率，且隨著加熱回流處理時間的增加，含量逐漸降低。由此可見，用水作為溶劑，冰浴超聲法提取肝硬克顆粒中丹酚酸B，操作簡單且避免了因丹酚酸B的熱不穩(wěn)定性而造成的損失，超聲時間定在30min為宜。

測定肝硬克顆粒樣品中丹酚酸B的含量時，小試的含量較高，但是混合較不均勻；成品的含量比小試的含量低，但是混合較均勻。可能是丹酚酸B的對熱不穩(wěn)定性，所以在成品混合過程中，丹酚酸B分解。因此在以后生產(chǎn)中，要注意成品混合時溫度的控制，保證成品中丹酚酸B的含量。

綜上所述，本試驗用水作為溶劑、冰浴超聲提取肝硬克顆粒中的丹酚酸B，并用高效液相色譜法測定其含量，結果準確、專屬性強、操作簡便、成本低，適合于肝硬克顆粒中丹酚酸B含量的測定。

表3　樣品的含量測定結果（n=3）

[參考文獻]

[1]蔡少青，秦路平，陳道峰，等.生藥學[M].6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：215.

[2]肖玲芳，張衛(wèi)芳，龔志成.丹酚酸B的心血管藥理研究進展[J].中南醫(yī)學科學雜志，2015，43（1）：90-94.

[3]趙先，王婧雯，陸楊，等.丹酚酸B藥理作用的研究進展[J].西北藥學雜志，2015，30（1）：107-110.

[4]徐靜瑤，劉小琳，佟玲，等.高效液相色譜法測定注射用丹參多酚酸中6種水溶性成分的含量[J].中國新藥雜志，2015，24（14）：1599-1603.

[5]李玉卿，趙文娟，夏永輝，等.中藥丹參對哮喘大鼠氣道重塑及基質金屬蛋白酶-9的影響[J].中國醫(yī)藥導報，2015，12（20）：12-15.

[6]羅娟敏，蘇加坤，田耀偉，等.HPLC法同時測定丹參藥材中丹酚酸B、丹參酮ⅡA含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（2）：25-27.

[7]楊贛軍，張小強，孫弋，等.丹酚酸B對培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元的影響[J].神經(jīng)解剖學雜志，2014，30（6）：705-708.

[8]張夏楠，關紅雨，高偉，等.中藥丹參資源開發(fā)現(xiàn)代研究進展[J].轉化醫(yī)學研究，2014，4（4）：26-36.

[9]趙輝，王麗萍，陳琳，等.多指標綜合評價優(yōu)選丹參提取工藝[J].中國醫(yī)藥導報，2014，11（8）：101-104.

[10]黃世超，瞿海斌.丹酚酸B穩(wěn)定性研究進展[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2015，32（5）：644-648.

[11]喻錄容，何先元，黃英如.HPLC同時測定冠心康顆粒中芍藥苷、丹酚酸B和羥基紅花黃色素A的含量[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2015，32（5）：561-564.

[12]袁春平，侯惠民，區(qū)淑.丹酚酸B的藥動學及相關研究進[J].中國新藥雜志，2015，24（7）：791-799.

[13]林超，劉兆國，錢星，等.丹酚酸B在心血管疾病中藥理作用研究進展[J].中國藥理學通報，2015，31（4）：449-452.

[14]張愛兵，張珺，程月發(fā)，等.高效液相色譜法測定丹參膠囊中8種有效成分的含量[J].中南藥學，2015，13（1）：80-82.

[15]杜文婷，劉萍.丹參單體對動脈粥樣硬化作用機制的研究概述[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2015，13（7）：902-905.

[16]王哲，袁子民，張會宗.HPLC法測定六君保玄顆粒中鹽酸小檗堿、丹酚酸B含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2015，17（8）：39-42.

[17]劉平，劉乃明，徐列明，等.丹酚酸乙對四氯化碳體外損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細胞的直接保護作用[J].中國中藥雜志，1997，22（5）：303.

[18]劉平，森澤成司，溇口靖綋.丹酚酸B-鎂鹽抗大鼠D-半乳糖胺肝損傷的作用[J].中國中西醫(yī)結合雜志，1993，13（6）：352.

[19]黃詒森，張均田.丹參中三種水溶性成分的體外抗氧化作用[J].藥學學報，1992，27（2）：96.

[20]王麗娜，陶艷艷，劉成海，等.丹酚酸B鹽對大鼠纖維化肝組織脂質過氧化及其MMP-2活性的影響[J].中國中藥雜志，2010，35（1）：71-75.

[21]盧名芹，潘陳為，李驥，等.丹酚酸B對肝纖維化大鼠TGF-β1、MMP-2和TIMP-2表達的影響[J].世界華人消化雜志，2007，15（36）：3847-3851.

[22]徐列明，劉成.丹參酚性酸B對大鼠傳代肝貯脂細胞增殖、形態(tài)和合成細胞外基質的影響[J].中華肝臟病雜志，1996，4（2）：86.

Content determ ination of salvianolic acid B in Ganyingke Granules

WANG Ruyi1HUANG Baiqi2LIN Sulan1
1.Experimental and Training Centre,Guangdong Food and Drug Vacational College,Guangdong Province,Guangzhou 510520,China;2.Department of Biotechnology,Guangdong Vacational College of Science and Trade,Guangdong Province,Guangzhou 510430,China

[Abstract]Objective To evaluate amethod for the determination of salvianolic acid B in Ganyingke Granules by high performance liquid chromatography(HPLC)method.M ethods Determination was conducted at 30°C and at 286 nm with a C18column(SHIMADZU,Diamonsil,250 mm×4.6 mm,5μm),and methanol-acetonitrile-formic acid-water (30∶10∶1∶59)was used asmobile phase.Results The regression equation was Y=14328C-6710.3(r=0.9998)with a linear range from 19.8 to 99.0μg/mL,average recovery was 96.85%,and RSD was 0.77%(n=6).Conclusion This method is accurate and easy to operate with good specificity,which is suitable for the content determination of salvianolic acid B in Ganyingke Granules.

[Key words]Salvianolic acid B;Ganyingke Granules;High performance liquid chromatography;Content determination

收稿日期：（2015-09-28本文編輯：趙魯楓）

[通訊作者]黃百祺（1983-），男，碩士，從事生物技術研究。

[作者簡介]王如意（1983-），男，碩士，從事天然藥產(chǎn)物研究。

[基金項目]廣東省中醫(yī)藥局科研課題項目（20141199）。

[中圖分類號]R927.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-7210（2016）01（a）-0039-04