非諾貝特對卵形鯧鲹PPAR α及CPTI基因表達的影響

方玲玲，陳　剛,2,3，王忠良,2,3，湯保貴,2,3，張健東，黃建盛，周　暉（.廣東海洋大學水產學院 //2.廣東省普通高校 南海水產經濟動物增養殖重點實驗室 //3.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東　湛江 524088）

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非諾貝特對卵形鯧鲹PPAR α及CPTI基因表達的影響

方玲玲1，陳剛1,2,3，王忠良1,2,3，湯保貴1,2,3，
張健東1，黃建盛1，周暉1
（1.廣東海洋大學水產學院 //2.廣東省普通高校 南海水產經濟動物增養殖重點實驗室 //3.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東湛江 524088）

摘要：對卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）腹腔注射20、50、100 mg/kg的激動劑非諾貝特，用RT-PCR檢測肝臟、肌肉中PPAR α和CPTI基因表達的變化趨勢，研究激動劑對卵形鯧鲹PPAR α和CPTI基因表達的影響。結果表明，PPAR α基因表達量50 mg/kg非諾貝特組高于其他組，差異有統計學意義（P ＜ 0.05），而CPTI表達量在20 mg/kg組有較高的表達水平（P ＜ 0.05）；50 mg/kg非諾貝特組中PPAR α基因表達量隨著時間的變化呈現先降低后恢復至初始水平的趨勢，CPTI表達量隨時間變化先升高后降低，隨后又升高的變化趨勢，肝臟組織中，CPTI表達量在注射后30 h達到最高（P ＜ 0.05），而在肌肉組織中18 h時達到最高值（P ＜ 0.05）；非諾貝特組PPAR α和CPTI基因的表達量均高于PBS對照組（P ＜ 0.05）。非諾貝特可誘導PPAR α基因的表達，但CPTI與PPAR α基因表達無較明顯的相關性。

關鍵詞：卵形鯧鲹；基因表達； PPAR α；CPTI；非諾貝特；RT-PCR分析

過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator activated receptors,PPAR s）是配體激活的核轉錄因子，有PPAR α、PPAR β及PPAR γ 3種亞型，其中PPAR α調控生物體的脂肪代謝，尤其對參與脂肪酸β氧化的多種酶類基因表達具有調控作用[1-2]。PPAR α具有棕櫚酸、油酸、花生四烯酸類代謝產物白三烯和前列腺素類等天然配體，以及氯貝特(Clofibrate)、非諾貝特(Fenofibrate)、WYl4643等人工化合物配體，這些配體作為激動劑可激活PPAR α進而調控與其相關基因的表達[3-4]。近年來，已有哺乳類[5-6]、鳥類[7-8]、魚類[9-10]PPAR α的研究，PPAR α配體相關研究也主要用于有關PPAR α疾病藥物的開發[11-12]。貝特類藥物是從氯貝丁酯衍生出來的一組化合物，可降低肝臟極低密度脂蛋白(VLDL)分泌，加強清除血漿甘油三酯（TG）[13-14]。祝慶[12]研究發現，非諾貝特可上調大鼠動脈壁組織中PPAR α表達水平，有效降低血脂水平，牛透明等[15]也證實了非諾貝特的降脂作用，可能誘導wister 大鼠脂蛋白脂酶（Lipoprteinlipase,LPL）活性升高和PPAR α基因表達，但鮮見魚類方面的相關研究。筆者以卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）為研究對象，腹腔注射微量非諾貝特，觀察不同藥物劑量下PPAR α及其調控的目的基因CPTI表達的變化趨勢，探討非諾貝特對二基因表達的影響以及PPAR α與CPTI表達的相關性，旨在探尋一種避免魚類脂肪過度蓄積的誘導劑，為魚類肉質形成等分子機制的深入研究提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料

健康卵形鯧鲹取自廣東海洋大學海洋生物研究基地，120尾，體質量（30 ± 1.0）g；非諾貝特（力平之），法利博福尼制藥公司；Trizol試劑、EasyScript反轉錄試劑盒、TransStart熒光定量試劑盒，北京全式金生物有限公司；ABI7500熒光定量PCR儀，美國ABI公司；引物由生工生物（上海）有限公司合成。

1.2方法

1.2.1實驗分組及樣品采集取卵形鯧鲹40尾隨機分為4組，每組魚10尾，參照文獻[4,11-12，15-16]中的非諾貝特劑量，每尾卵形鯧鲹分別腹腔注射20、50、100 mg/kg的非諾貝特以及PBS緩沖液（對照組）200 μL，于注射后12、24 h取樣，各濃度組每次取魚5尾冷凍麻醉處死，快速分離肝臟和肌肉組織，于液氮中速凍后，轉入- 80 ℃條件下保存備用。

另外，取卵形鯧鲹80尾，隨機分為2組，實驗組每尾魚腹腔注射濃度為50 mg/kg的非諾貝特200 μL，對照組注射同劑量的PBS緩沖液。分別在注射后6、12、18、24、30、36、42、48 h取樣，兩組每個時間點分別取5尾魚的肝臟和肌肉組織于-80℃條件下保存備用。

1.2.2總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成取- 80 ℃保存的各組織約100 mg，按照UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒中推薦的方法提取、純化總RNA。按照EasyScript反轉錄試劑盒推薦的體系，以Oligo(dT)18為引物，按照42 ℃ 1 h、85 ℃ 5 min的步驟來合成cDNA第一鏈。

1.2.3實時熒光定量PCR分析根據卵形鯧鲹PPAR α cDNA序列（GenBank登錄號KP893147）和CPTI基因cDNA序列（GenBank登錄號KP987456）設計特異性引物PPAR α（A）和PPARα（S），CPTI（A）和CPTI（S），以卵形鯧鲹β-actin為內參基因，設計引物β-actin(A)、β-actin（S）（表1）。實驗操作按照TransStart Tip Green qPCR試劑盒的使用方法，在ABI7500實時熒光定量PCR儀上進行RT-PCR反應。每個樣品均設3個復孔，進行3組平行反應。PPAR α反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，52.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 5 min。CPTI反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，51 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40個循環；72 ℃ 5 min。通過與β-actin基因的比較，運用ΔΔCT方法計算卵形鯧鲹肝臟、肌肉組織中PPAR α和CPTI基因的相對表達量2-ΔΔCT，實驗數據采用SPSS19.0進行單因素顯著性分析和Duncan多重性比較。

表1　引物序列Table 1　Primer Sequences

2　結果與分析

2.1總RNA質量檢測

提取的總RNA樣品經10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳顯示清晰的28S和18S rRNA條帶（圖1），微量核酸定量儀測定其D（260 nm）/D（280 nm）值在1.8～2.0之間，說明提取的總RNA完整性良好，可以用于下一步實驗。

圖1　肝臟與肌肉的總RNAFig.1　Total RNA from liver and muscle

2.2非諾貝特濃度組PPAR α和CPTI的基因表達

在肝臟組織中（圖2），PPAR α表達量與注射后12 h相比，24 h時20、50 mg/kg組升高，50 mg/kg組變化最大。100 mg/kg組表達量各時間點均較高，明顯高于PBS對照組（P ＜ 0.05），50 mg/kg組則僅24 h時高與PBS組。而CPTI表達量各非諾貝特組12 h時均低于24 h，而對照組則相反；20 mg/kg組12 h時表達量明顯遠高于其他各組（P ＜ 0.05），至24 h時各組表達量均低于PBS對照組（P ＜ 0.05）。

圖2 不同藥物濃度下肝臟PPAR α和CPTI基因表達量Fig.2　Relative expression analysis of PPAR α and CPTI gene in liver with different concentrations of fenofibrate solution

在肌肉組織中，不同非諾貝特濃度下卵形鯧鲹PPAR α和CPTI基因的相對表達量不同。圖3表明，PPAR α表達量由高到低依次總體上是50 mg/kg、PBS、20 mg/kg、100 mg/kg組。24 h時20、50 mg/kg組表達量相對于12 h時升高。50 mg/kg與100 mg/kg組間表達差異各時間點均有統計學意義（P ＜ 0.05）。CPTI基因在20 mg/kg的濃度下相對表達量最高（P ＜ 0.05），50 mg/kg組次之，100 mg/kg與PBS組相當（P ＞ 0.05）。24 h 時20、50 mg/kg組表達量相對于12 h時降低。

圖3 不同藥物濃度下肌肉PPAR α和CPTI基因表達量Fig.3　The relative expression analysis of PPAR α and CPTI gene in muscle with different concentrations of fenofibrate solution

2.3不同時間PPAR α和CPTI的基因表達

肝臟組織PPAR α和CPTI表達量見圖4。圖4可見，非諾貝特組PPAR α表達量隨時間大體上呈先緩慢降低再恢復至初始水平的趨勢（12 h時表達量明顯降低，可能是由RNA提取、反轉錄或者實時熒光定量操作過程時的失誤導致了RNA降解或其他原因所致），各時間點均高于PBS對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明50 mg/kg非諾貝特可有效促進PPAR α的表達。同樣，CPTI表達量各組亦有差別，非諾貝特組CPTI表達量在0～12 h內升高，12～24 h內降低，隨后快速升高，在注射后30 h達到最高（P ＜ 0.05），然后呈緩慢下降趨勢（圖4）。除24 h外，各時間點50 mg/kg組的CPTI表達量均高于PBS對照組（P ＜ 0.05），表明非諾貝特可有效促進CPTI基因的表達。

圖4　50 mg/kg非諾貝特對卵形鯧鲹肝臟中PPAR α 和CPTI基因相對表達量的影響Fig.4　Relative expression analysis of PPAR α and CPTI gene in livers with 50 mg/kg fenofibrate solution

肌肉組織PPAR α和CPTI表達量見圖5。圖5可見，非諾貝特組PPAR α表達量隨時間變化先降低后升高（圖5），各時間點均明顯高于PBS對照組（P ＜ 0.05）；而CPTI則隨時間變化先升高，18 h時達到最大值，后又降低，各時間點表達量均明顯高于PBS對照組（P ＜ 0.05）（圖5）。因此，50 mg/kg的非諾貝特可有效促進肌肉中PPAR α和CPTI基因的表達。

圖5　50 mg/kg非諾貝特對卵形鯧鲹肌肉中PPAR α 和CPTI 基因的相對表達量的影響Fig.5　The relative expression analysis of PPAR α and CPTI gene in muscles with 50 mg/kg fenofibrate solution

3　討 論

PPAR α是核受體超家族的一員，具有多種生物學效應，可通過調控脂肪酸氧化過程中脂蛋白脂酶（LPL）、肉堿棕櫚酰基轉移酶I、II（CPTI、CPTII）、脂肪酸轉運蛋白（FATP-1）等[13-14,17]酶類來調節脂肪酸代謝，進而調節機體血脂含量[18-19]。PPAR α與其配體相互作用調節目的基因的表達主要通過以下環節進行：首先，PPAR α與飽和/不飽和脂肪酸及其衍生物等天然配體或者貝特類（Fibrate）和噻唑烷二酮類（TZDs）等人工合成配體結合，激活PPAR α，并與9-順式視黃醇X受體（RXR）結合形成異質二聚體，接著與目的基因的啟動區的PPAR特異性反應元件（peroxisome proliferator responsive element，PPRE）結合，發揮轉錄調控作用[16,20-23]。非諾貝特是PPAR α的人工合成配體之一，是化學合成的苯氧酸衍生物類藥物，早已獲美國批準，并被廣泛用于臨床降血脂，其安全性已得到大量臨床數據支持，研究發現其降血脂的作用主要是通過PPAR α來調控脂肪代謝相關基因表達[24]來實現的。本研究以卵形鯧鲹為研究對象，以非諾貝特為PPAR α配體來誘導PPAR α表達，通過觀察PPAR α和CPTI基因的相對表達量，尋找一種可以誘導食物中的脂質轉化為能量，避免魚類脂肪過度沉淀蓄積的誘導劑[16]。結果表明，50 mg/kg的非諾貝特對卵形鯧鲹肌肉組織的PPAR α基因誘導作用顯著，在肝臟組織中，100 mg/kg組誘導作用亦較佳。PPAR α的相對表達量隨時間先降低后恢復至初始水平，提示非諾貝特對PPAR α的誘導作用可能是一種反饋調節的作用方式。

CPTI是線粒體脂肪酸β氧化的一種“限速酶”，主要調控長鏈脂肪酸穿過線粒體膜進行β氧化，是脂質轉化為能量的關鍵酶。CPTI基因的啟動區上游存在PPRE應答元件，其表達受PPAR α的調控[25-26]。本研究中，在非諾貝特劑量為20 mg/kg時，CPTI的相對表達量較高，且在非諾貝特劑量為50 mg/kg時，隨著時間的變化，CPTI的相對表達量呈先升后降之后又升高的變化趨勢，在肝臟組織中，CPTI表達量在注射后30 h達到最高值，而肌肉組織中的CPTI在注射后18 h有最高表達量。在適量濃度的非諾貝特作用下，卵形鯧鲹PPAR α和CPTI的表達量總體上均高于PBS對照組，可認為該藥物對二基因表達均有上調作用，但二基因的表達量之間隨時間變化卻無明顯的相關性，猜測PPAR α對CPTI的調控可能通過更為復雜的途徑發生作用，PPAR α在非諾貝特的誘導下對CPTI進行調控的具體機制尚有待進一步研究。

4　結　語

本研究表明，適宜濃度的非諾貝特均可上調PPAR α和CPTI基因的表達，PPAR α的表達隨時間變化表現出反饋調節的作用。CPTI基因的表達與PPAR α基因表達間無明顯的相關性，或許顯示其基因的表達是一個更為復雜的調控過程。可見，合適濃度的非諾貝特可作為避免魚類脂肪過度沉淀蓄積的候選誘導劑，通過注射作用于魚體，誘導脂肪代謝相關基因PPAR α和CPTI的表達來調控脂質轉化為能量，維持魚體營養代謝平衡，改善魚肉品質。當然，尚需進行一系列非諾貝特相關的毒性機理研究，才有望最終應用于養殖實驗中。

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（責任編輯：劉慶穎）

Effects of Fenofibrate on Relatively Expression of Gene PPAR α and CPTI

FANG Ling-ling1,CHEN Gang1,2,3,WANG Zhong-liang1,2,3,TANG Bao-gui1,2,3,ZHANG Jian-dong1,HUANG Jian-sheng1,ZHOU Hui1
（1.Fisheries College of Guangdong Ocean University //2.Key laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquaculture Economic Animal of Guangdong Higher Education Institutes Laboratory of Fish Aquaculture //3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals,Zhanjiang 524088,China）

Abstract:The fenofibrate solution with concentration of 20,50,100 mg/kg were injected into the abdomen of Trachinotus ovatus respectively,and the expression of gene PPAR alpha and CPTI in livers and muscles were analyzed by RT-PCR,and the effects of the agonists on relatively expression of PPAR α and CPTI gene was studied.The result showed that the expression of PPAR α in group 50 mg/kg is significant higher than that in other groups(P ＜ 0.05),and CPTI had higher expression in group 20 mg/kg(P ＜ 0.05).The expression of PPAR α and CPTI gene had no significant difference in PBS group(P ＞ 0.05),but the expression of PPAR α in group 50 mg/kg firstly increased and decreased and then returned to the initial level trend finally as time changed.Meantime,thebook=14,ebook=17expression of CPTI gene fell after rose and then rose at last as the time gone by.The highest expression appeared at 30 h after injection in livers and the highest expression appeared at 18 h in muscles(P ＜ 0.05).The expression of gene PPAR alpha in livers and muscles with fenofibrate solution is higher than that with PBS.In conclusion,the fenofibrate can induce the expression of PPAR α,but the correlation of the expression between PPAR α and CPTI is not obviously.

Key words:Trachinotus ovatus; gene expression; fenofibrate; PPAR α; CPTI; RT-PCR

通信作者：陳剛（1961－），男，教授，研究方向為魚類種子工程與增養殖。E-mail：cheng@gdou.edu.cn

基金項目：國家海洋公益性行業科研專項（201205028）；廣東省海洋經濟創新發展區域示范專項（GD2012-A01-007，GD2012-A02-003）；廣東省教育廳創新計劃專項（2012KJCX0063）；廣西科技廳科技計劃（桂科攻1222013-2）

收稿日期：2015-08-17

doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.003

中圖分類號：Q786

文獻標志碼：A

文章編號：1673-9159（2016）01-0013-06

第一作者：方玲玲（1990－），女，碩士研究生，研究方向為魚類種子工程與生物學。E-mail：1176950041@qq.com