溶藻弧菌肽聚糖和vp28-siRNA對凡納濱對蝦白斑綜合征病毒的抑制作用

朱衛衛，邱德全，甘　楨，魯義善，簡紀常(廣東海洋大學 水產學院 //廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室 //廣東省教育廳水產經濟動物病害控制重點實驗室,廣東　湛江　524025)

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溶藻弧菌肽聚糖和vp28-siRNA對凡納濱對蝦白斑綜合征病毒的抑制作用

朱衛衛，邱德全，甘楨，魯義善，簡紀常
(廣東海洋大學 水產學院 //廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室 //廣東省教育廳水產經濟動物病害控制重點實驗室,廣東湛江524025)

摘要：對感染白斑綜合征病毒（WSSV）的凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）分別注射0.05和0.10 μg/μL 的vp28-siRNA，干擾效果實驗表明，siRNA最佳濃度為0.10 μg/μL。凡納濱對蝦感染WSSV 24 h時注射0.10 μg/μL 的vp28-siRNA，檢測免疫后不同時間點的干擾效果。結果表明：在注射vp28-siRNA 6 h后，實驗組與對照組WSSV病毒拷貝數差異有統計學意義（P ＜ 0.05)；在48 h時實驗組病毒拷貝數急劇下降，對照組則保持較高水平，可較好干擾WSSV病毒復制，干擾效果持續120 h，對凡納濱對蝦的保護率為40%。凡納濱對蝦用0.10 mg/mL肽聚糖（Peptidoglycan）免疫24 h后感染WSSV，檢測6、12、24 h注射vp28-siRNA的保護率。結果顯示：6 h注射組的保護率為80%，12 h注射組為63.33%，24 h注射組為56.67%。凡納濱對蝦在肽聚糖和vp28-siRNA作用后，可增加其對WSSV抗感染作用，降低死亡率，干擾時間越早，對對蝦的保護率越高。

關鍵詞：凡納濱對蝦；免疫增強劑；RNA干擾；肽聚糖；vp28-siRNA；白斑綜合征病毒

Key word:Litopenaeus vannamei; immunopotentiating agent; RNA interference; peptidoglycan; vp28-siRNA; White Spot Syndrome Virus

對蝦有成熟的非特異性免疫系統。肽聚糖（Peptidoglycan，PG）[1]、脂多糖（Lipopoly saccharide,LPS）[2]、葡聚糖（Glucan）及藻類多糖[3]等具有促進或誘發宿主防御反應，增強生物機體抗病能力的作用，稱為對蝦免疫增強劑，這些免疫增強劑研究為對蝦養殖中病害防治新型藥物開發開辟了新思路[4-5]。肽聚糖取自微生物細胞壁，因此細菌進入機體時被識別出來，激發起體內的免疫功能，是免疫增強劑的重要成員，可提高機體多種免疫因子活力，增強抗病力[6]。

白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）是引發亞洲地區對蝦病毒性流行病主要病原[7]，給對蝦養殖業造成巨大損失[8-9]。目前，學界多采用添加中草藥及制劑[10-13]、使用免疫增強劑[14-16]、注射抗體[17-18]或疫苗[19]等方法增強對蝦免疫力，以防治WSSV。此外，細胞內的Dicer酶可將外源dsDNA剪成siRNA，與核酸酶合成沉默復合體及解旋雙鏈siRNA，以siRNA為向導選擇底物降解為與其同源的mRNA序列，這種現象稱為RNA干擾（RNAi）。對蝦體內不存在干擾素相關基因，不會誘發先天性免疫反應而降解dsRNA和siRNA，因此，可給對蝦注射siRNA進行RNAi實驗[20]。已有研究[21-22]表明，對蝦注射WSSV的相應dsRNA[21]或siRNA[22]后，可減少體內病毒的復制。上述研究均為單方面增強機體的免疫能力或利用RNAi有效干擾WSSV復制以防治WSSV，筆者用肽聚糖注射免疫凡納濱對蝦（Litoprnaeus vannamei）后，用WSSV攻毒，再注射vp28-siRNA，研究肽聚糖和siRNA對對蝦的免疫保護率，為凡納濱對蝦抗WSSV研究提供新的方法和思路。

1　材料與方法

1.1實驗用蝦及病毒原液

凡納濱對蝦（L.vannamei），體長（9.5 ± 0.3）cm，體質量（11.0 ± 0.6）g，取自湛江市東海島東南庵里湛江騰飛實業有限公司對蝦養殖場。經PCR檢測，確認未攜帶白斑綜合癥病毒。對蝦于1 m × 1 m × 0.8 m的水槽中暫養7 d，養殖條件：鹽度24，水溫28～32℃，每日按對蝦體質量10%的劑量投喂配合飼料3次，連續充氣，日換水量約1/3。

WSSV病毒粗提液由廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室（下稱本實驗室）-80℃超低溫保存。

1.2肽聚糖提取和溶液配制

參照謝警鴻[23]和劉春曉[24]方法提取溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）（本實驗室保存）細胞壁的肽聚糖，用分析天平稱量0.1 g的肽聚糖（純度98.5%），溶入10 mL的BSS緩沖液（NaCl 18.0 g/L，KCl 0.7 g/L，NaHCO30.5 g/L，KH2PO40.54 g/L，調pH至7.2），用超聲波溶解配制成0.1 mg/mL的肽聚糖溶液。

1.3siRNA選擇與合成和熒光定量引物設計

siRNA來自WSSV主要囊膜蛋白vp28基因，李詠梅[25]等已在倉鼠腎（Baby hamster kidney，BHK）細胞中驗證3條siRNA的有效性。選用其中一條siRNA和陰性對照siRNA（Negative control siRNA，nc-siRNA）。登陸NBCI搜索得WSSV vp28基因（GenBank登錄號DQ681069）的全mRNA序列，引物W120和vp28用Premier 5軟件設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1　siRNA和熒光定量引物Table 1　siRNA and quantitative real-time PCR primers

vp28-siRNA和nc-siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。合成的vp28-siRNA用BSS緩沖液（DEPC水處理）配制成0.10和0.05 μg/μL溶液，nc-siRNA配制成0.05 μg/μL溶液。

1.4熒光定量PCR及標準曲線繪制

采用程曉燕等[26]的方法制備vp28重組質粒標準品，用核酸分析儀測定重組質粒的DNA 濃度，計算重組質粒的拷貝數，公式如下。

重組質粒的拷貝數=質粒質量濃度(μg/μL)× 10?6× 6.02 ×1023/重組質粒相對分子質量。

熒光定量PCR的反應體系：SYBR PremixEx Taq TM(2×)12.5 μL，模板1 μL，0.2 μmol/L引物2.0 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR結束后，利用Rotor-Gene軟件查看擴增曲線，計算Ct(Cyclethreshold)值，以及計算重組質粒不同稀釋度（拷貝數）與Ct值的相關性，從而得到標準曲線。

1.5siRNA最佳濃度的確定

實驗分4組，記為DZ、SR1、SR2、CZ組，每組對蝦5尾，每尾分別肌肉注射100 μL稀釋104倍的病毒粗提液。24 h時，SR2組注射100 μL的0.05 μg/μL vp28-siRNA，SR1組注射100 μL的0.10 μg/μL vp28-siRNA，DZ組僅注射100 μL的BSS緩沖液（陰性對照組），CZ組注射100 μL的nc-siRNA（陽性對照）。48 h時，分別取對蝦的鰓組織提取DNA用于半定量PCR檢測WSSV。反應體系（25 μL）含10×ExTaq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，病毒粗提液1.0 μL，Ex Taq(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O 17.3 μL。反應條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 45 s，30循環；72℃ 1 min，72℃ 10 min。擴增結束后每組（5平行組）PCR產物合成一管，取其中的10 μL作10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳。

1.6siRNA對凡納濱對蝦WSSV抗感染效果

設3個實驗組，記為WS、SR、BS組，每組設置3個平行組，每個平行組對蝦10尾。WS和SR實驗組每尾各注射稀釋104倍的病毒粗提液100 μL，BS組注射BSS緩沖液100 μL。24 h時，SR組注射100 μL vp28-siRNA（濃度為1.5節結果）。觀察7 d，記錄每天對蝦死亡數，計算免疫保護率。

設實驗組、對照組，每組設置3個平行組。每平行組對蝦30尾，每尾各注射100 μL稀釋104倍的病毒粗提液。24 h時，實驗組每尾注射100 μL vp28-siRNA（濃度為1.5節的最佳濃度）。在注射后0、6、12、24、48、72、96、120 h時采集各組對蝦鰓組織，每組每個時間點各取3尾，用熒光定量PCR檢測WSSV變化情況。

1.7肽聚糖和vp28-siRNA 對凡納濱對蝦抗WSSV的影響

根據劉春曉[24]的結果，實驗用肽聚糖質量濃度為0.1 mg/mL，所用病毒為稀釋104倍的WSSV粗提液[14]，vp28-siRNA濃度為1.5節的濃度結果。設5個實驗組，分別記為PS、WS、PS6、PS12、PS24組，每組設置3個平行組，每平行組對蝦30尾。各組處理如表2所示。

實驗連續充氣，日換水量約為1/3，定時吸出排泄物，及時取出死亡對蝦。記錄各組感染后 7 d的凡納濱對蝦死亡數。

1.8數據處理

所得數據采用SPSS20.0進行單因素方差分析和Duncan多重比較，用Excel作圖。

表2　實驗分組Table 2　The experiment designs the different groups

2　結 果

2.1絕對定量標準曲線繪制

用核酸分析儀測定vp28重組質粒的DNA 濃度為27.7 ng/μL，根據計算公式得到質粒中的目的基因拷貝數為3.93×109copies/μL，將其進行連續10倍稀釋得到3.93×108、3.93×107、3.93×106、3.93×105、3.93×104、3.93×103和3.93×102copies/μL，進行熒光定量測定。結果見圖1，其中R2=0.999 9，說明該方程線性相關性較佳，可用于計算病毒拷貝數。

2.2siRNA最佳濃度確定

圖2可見，SR1條帶亮度低于其他實驗組，表明注射100 μL 0.10 μg/μL vp28-siRNA實驗組病毒數量最少。用熒光定量PCR檢測攻毒48 h時各組病毒的拷貝數見圖3。圖3表明，SR1組病毒拷貝數最少，與其他各組差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。表明注射0.10 μg/μL的vp28-siRNA干擾WSSV效果較好，可用于下一步實驗。

圖1　WSSV基因熒光定量PCR標準曲線Fig.1　Standard curve of WSSV gene fluorogenic quantitative real-time PCR

圖2　WSSV半定量PCR鑒定結果Fig.2　Semi-quantitative PCR identification of WSSV

圖3　攻毒48 h時凡納濱對蝦攜帶WSSV拷貝數Fig.3　Copy number of WSSV in Litopenaeus vannamei at 48 h after challenged with WSSV

2.3vp28-siRNA對凡納濱對蝦的抗WSSV存活率影響及WSSV攜帶情況

用質量濃度為0.10 μg/μL vp28-siRNA免疫感染WSSV 24 h的凡納濱對蝦，各組對蝦存活率如表3所示。表3可見，對照組WS組7 d內死亡率達到100%；經vp28-siRNA免疫的SR組對蝦死亡率為60%，保護率為40%。

表3　vp28-siRNA對凡納濱對蝦的抗WSSV存活率的影響Table 3　Effects of vp28-siRNA on Litopenaeus vannamei infected WSSV

注射vp28-siRNA后各時間點病毒的DNA熒光定量PCR檢測結果如圖4所示。圖4表明，在0 至24 h之間，病毒不斷繁殖，其拷貝數快速倍增，但實驗組低于對照組（P ＜ 0.05）；24 h后實驗組病毒拷貝數急劇下降，48 h時， 實驗組病毒拷貝數明顯低于對照組，差異有統計學意義（P ＜ 0.01），一直持續到120 h，而對照組則保持高水平的病毒拷貝數。

圖4　vp28-siRNA對凡納濱對蝦攜帶WSSV拷貝數的影響Fig.4　Effects of vp28-siRNA on the WSSV copy number in Litopenaeus vannamei

2.4肽聚糖和vp28-siRNA對凡納濱對蝦感染WSSV存活率的影響

先用0.10 mg/mL肽聚糖對凡納濱對蝦免疫24 h，感染WSSV之后不同時間點注射vp28-siRNA，各組對蝦存活率如表4。對照組和陰性對照組對蝦的死亡率都為100%，PS6組的保護率為80%，PS12組的保護率為63.33%，PS24的保護率為56.67%。結果顯示，注射vp28-siRNA時間點越后，凡納濱對蝦的保護率越低，仍有56.67%的保護率。

表4　肽聚糖和 vp28-siRNA對凡納濱對蝦的抗WSSV存活率的影響Table 4　Effects of peptidoglycan and vp28-siRNA on Litopenaeus vannamei against WSSV

3　討 論

vp28是WSSV的一個高豐度的囊膜蛋白，在病毒初始感染對蝦中起關鍵作用[27]，抑制vp28的轉錄與翻譯，對對蝦WSSV的抗感染效果較好。李詠梅等[25]發現，siRNA在BHK細胞中對vp28基因的干擾效率維持在50%～70%。Xu等[28]把siRNA注射到體內后可成功抑制VP28在轉錄和翻譯水平的表達，抑制病毒的復制，提高對蝦對病毒的抵抗力。Zhu等[29]證明，把siRNA注射凡納濱對蝦體內也有同樣效果，其免疫保護率約為40%。本研究表明，凡納濱對蝦注射vp28-siRNA后，其保護率為40%，與文獻[29]結果一致，間接說明干擾WSSV病毒vp28可有效控制WSSV的感染。

本研究以WSSV囊膜蛋白vp28為模板設計實驗用siRNA，確定vp28-siRNA質量濃度為0.10 μg/μL時干擾WSSV效果最佳。有研究證明，在凡納對蝦體內注射10 μg siRNA的干擾病毒效果最佳[30]，與本研究相符。在對蝦注射vp28-siRNA 48 h時（圖4），實驗組對蝦體內病毒拷貝數與對照組相比急劇降低，差異有統計學意義（P ＜ 0.01），說明干擾效果明顯，效果可持續到120 h，這是RNAi信號擴增機制的作用結果，即在機體內以siRNA為引物，靶mRNA為模板，在RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRP）作用下通過聚合酶鏈式反應生成新的長的dsRNA，新生dsRNA再進入下一個RNAi循環。有研究證明導入的雙鏈RNA可誘導RNA干擾，其抑制效應可穩定存在5 d以上[31]，與本實驗干擾效果維持時間相符。在通過肽聚糖免疫后，再用siRNA注射到對蝦體內，獲得免疫保護率最高可達80%（表4），高于單注射肽聚糖（46.67%）和單注射siRNA（40%）的免疫保護率。說明一方面通過siRNA來干擾WSSV復制，導致WSSV不能大量繁殖；另一方面由于機體前期受肽聚糖免疫刺激后，免疫功能增強，把WSSV病毒顆粒快速消除，從而減少對蝦在感染WSSV后死亡。但肽聚糖提取和siRNA制備費用昂貴，無法大量應用于對蝦養殖，可為對蝦抗病毒研究提供新的思路。

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（責任編輯：劉慶穎）

Effects of Vibrio alginolyticus Peptidoglycn and vp28-siRNA on Litopenaeus vannamei Against White Spot Syndrome Virus

ZHU Wei-wei,QIU De-quan,GAN Zhen,LU Yi-shan,JIAN Ji-chang
（College of Fisheries,Guangdong Ocean University //Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals //Key Laboratory of Control for Disease of Aquatic Animals of Guangdong Higher Education Institutes,Zhanjiang 524025,China）

Abstract：Vp28-siRNA at the concentration of 0.05 and 0.10 μg/μL was injected into Litopenaeus vannamei suffered from White Spot Syndrome(WSS),respectively.The optimum concentration of vp28-siRNA was 0.10 μg/mL by interference effect experiment.L.vannamei was challenged with White Spot Syndrome Virus(WSSV),and was stimulated by vp28-siRNA at 24thday after infection.The effects of vp28-siRNA interference at different times were detected.The results showed that the experimental group had statistical differences from the control group(P ＜ 0.05)at the 6th hour,and WSSV copy number had a rapid decline at 48th hour and the good interference replication of WSSV lasted until the 120th hour.The protection rate was 40%.L.vannamei immuned by peptidoglycan(0.1 μg/mL)was infected with WSSV.Then vp28-siRNA was injected at the differentbook=58,ebook=61times(6 h,12 h and 24 h)into the shrimps and the protection rate was measured.The results revealed that the protection rate of group 6 h,12 h and 24 h was 80%,63.33% and 56.67%,respectively.It is more effective to interfere with WSSV so that it can reduce shrimp mortality,after L.vannamei immuned with peptidoglycan and vp28-siRNA,and the earlier interference,the higher rate of protection.

中圖分類號：S945.4+9

文獻標志碼：A

文章編號：1673-9159（2016）01-0057-06

通信作者：邱德全，男，教授，研究方向為水產經濟動物免疫與病害控制。E-mail：qmsld@163.com

基金項目：廣東省海洋漁業科技推廣專項項目(A201100D03)，廣東省海洋經濟創新發展區域示范專項項目(GD2012-A03-012)，湛江市科技計劃項目(2013A03021)
第一作者：朱衛衛（1986－），男，碩士研究生，研究方向為水產經濟動物免疫與病害控制。E-mail：zhuweiwei320@163.com

收稿日期：2013-06-30

doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.010