小檗堿對人前列腺癌細胞株PC3增殖、凋亡的影響及其機制

鐘靜，劉杉，楊應，魏晶，黃晶晶，熊校勤

(湖北第二師范學院植物抗癌活性物質提純與應用湖北省重點實驗室，武漢430205)

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小檗堿對人前列腺癌細胞株PC3增殖、凋亡的影響及其機制

鐘靜，劉杉，楊應，魏晶，黃晶晶，熊校勤

(湖北第二師范學院植物抗癌活性物質提純與應用湖北省重點實驗室，武漢430205)

目的觀察小檗堿對人前列腺癌細胞株PC3增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機制。方法取對數生長期PC3細胞分為A、B、C、D、E組，分別加入終濃度為10、25、50、75、100 μmol/L小檗堿培養，對照組只加ddH2O。觀察培養24、48 h時各組細胞增殖情況。另取培養48 h時PC3細胞(觀察組)，加入終濃度為 75 μmol/L小檗堿培養，對照組只加細胞培養液，觀察細胞凋亡情況，檢測剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)、B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)。結果隨濃度升高，A、B、C、D、E組細胞增殖抑制率增加，P均<0.05；隨培養時間增加，A、B、C、D、E組細胞增殖抑制率增加，P均<0.05。培養48 h時觀察組及對照組細胞凋亡率分別為74.43%±5.69%、2.51%±0.86%，觀察組細胞凋亡率與對照組比較明顯升高(P<0.05)。培養48 h時觀察組細胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白的相對表達量分別為0.30±0.02、0.56±0.03、0.37±0.03、0.10±0.01,對照組分別為0.15±0.04、0.41±0.03、0.58±0.04、0.11±0.02。與對照組相比，觀察組細胞Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白的相對表達量均升高，Bcl-2蛋白的相對表達量降低(P均<0.05)，而LC3蛋白的相對表達量無明顯變化。 結論小檗堿可抑制PC3細胞增殖、促進細胞凋亡，其機制可能與小檗堿可上調Cleaved-Caspase-3、Bax表達，抑制Bcl-2表達有關。

小檗堿；前列腺癌；細胞增殖；細胞凋亡；自噬

前列腺癌是中、老年男性常見的泌尿系統惡性腫瘤[1]。其發病率和病死率分別居全球男性癌癥的第2位和第6位，且呈逐年遞增趨勢[2]。前列腺癌的發病機制目前尚不明確，既往研究[3]認為細胞增殖和凋亡的失衡是其發生、發展的重要因素。凋亡和自噬是細胞死亡的兩種形式。兩者機制不同，但是存在復雜的交互調控作用。B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)和Bcl-2相關X蛋白(Bax)是調控細胞凋亡的關鍵因素，前者具有抑制凋亡作用，而后者具有促進凋亡作用[4]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)在細胞凋亡過程中關鍵的凋亡執行分子，參與許多凋亡信號傳導途徑[5,6]。而微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)則是重要的檢測自噬體形成的特異性標記蛋白[7,8]。小檗堿是一種喹啉生物堿，主要存在于毛莨科、蕓香科和小檗科等植物中[9]；因具有清熱解毒和抗菌消炎的功效，傳統中醫中長期用于治療細菌導致的胃腸道疾病[10,11]。最新研究發現，小檗堿可提高糖尿病患者的胰島素抵抗、改善高血脂[12,13]。同時其抗腫瘤活性較高，但其抗腫瘤的具體作用機制及其通道尚未完全闡明[14～16]。2014年4月～2015年12月，我們觀察了小檗堿對人前列腺癌細胞株PC3增殖及凋亡的影響，并探討其可能機制。現將結果報告如下。

1　材料與方法

1.1細胞、藥物、儀器及試劑PC3細胞購自中國典型培養物保藏中心，置于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，37 ℃、5% CO2條件下培養。細胞貼壁生長，0.25%胰蛋白酶消化傳代。小檗堿、MTT購自Sigma公司。DMEM培養基及胎牛血清購于Gibco公司,細胞裂解液來自碧云天生物技術研究所,GAPDH、Bcl-2、Bax、剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)、LC3抗體購自CST公司。蛋白電泳儀和半干轉膜儀購自Bio-RAD公司。

1.2小檗堿對PC3細胞增殖的影響觀察采用MTT法。取對數生長期PC3細胞，3×103/孔接種于96孔板，分為A、B、C、D、E組，分別加入終濃度為10、25、50、75、100 μmol/L小檗堿培養，對照組只加ddH2O。分別于培養24、48 h時取各組細胞，加入5 mg/mL MTT 10 μL，孵育4 h，離心后取上清，加入150 μL DMSO，輕微振蕩 10 min，使結晶物充分溶解，采用酶標儀檢測各組在570 nm 波長處的吸光度(A)，計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-A實驗組/A對照組)×100%。重復3次，取平均值。

1.3小檗堿對PC3細胞凋亡的影響觀察及細胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3檢測①小檗堿對PC3細胞凋亡的影響觀察：采用流式細胞儀。取對數生長期觀察組細胞，1×106/mL接種于96孔培養板中，加入終濃度為75 μmol/L的小檗堿培養，每組5個復孔，對照組只加培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h。各取100 μL兩組細胞懸液，加入5 μL Alexa Fluor@488 annexin V和100 μg/mL PI 1 μL，混勻后室溫避光孵育15 min。采用流式細胞儀檢測兩組培養48 h時細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。②細胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白檢測：采用Western blotting法。培養48 h時取兩組對數生長期細胞，胰蛋白酶消化，PBS洗兩次，加入150 μL細胞裂解液混勻，冰上放置30 min使細胞充分裂解，獲取上清液。BCA法提取總蛋白，取30 μg總蛋白，12% SDS-PAGE電泳90 min，半干轉膜儀轉膜40 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜，加入兔抗大鼠Bax和Bcl-2一抗(1∶1 000)、兔抗大鼠Cleaved-Caspase-3一抗(1∶500)、兔抗大鼠LC3一抗(1∶500)4 ℃過夜。TBST洗膜4次，每次5 min；加入山羊抗兔Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3和LC3二抗(1∶2 000)封閉1 h，顯色曝光。以GAPDH作為內參，用Image J軟件進行灰度掃描進行定量分析。以目的蛋白與GAPDH灰度值之比作為Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2　結果

2.1不同時間點各組細胞增殖抑制率比較培養24 h時A、B、C、D、E組的細胞增殖抑制率分別為0.69%±0.22%、14.19%±1.38%、32.15%±2.63%、38.87%±1.09%、44.27%±1.95%，隨濃度升高，A、B、C、D、E組細胞增殖抑制率增加，P均<0.05。培養48 h時A、B、C、D、E組的細胞增殖抑制率分別為6.60%±3.80%、20.23%±7.62%、38.12%±1.66%、46.35%±1.56%、63.36%±2.06%，隨培養時間增加，A、B、C、D、E組細胞增殖抑制率增加，P均<0.05。

2.2兩組細胞凋亡率及細胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白比較培養48 h時觀察組及對照組細胞凋亡率分別為74.43%±5.69%、2.51%±0.86%，觀察組細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)。培養48 h時觀察組細胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白的相對表達量分別為0.30±0.02、0.56±0.03、0.37±0.03、0.10±0.01,對照組分別為0.15±0.04、0.41±0.03、0.58±0.04、0.11±0.02，與對照組相比，觀察組組細胞Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白的相對表達量升高，Bcl-2蛋白的相對表達量減低，而LC3蛋白的相對表達量無明顯變化(P均<0.05)。

3　討論

前列腺癌是發生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，其發生與多種因素有關。在直系男性親屬患前列腺癌的家族中，其男性發病率明顯增高。雄激素可以促進前列腺癌的生長，體內雄激素水平較高可能也是前列腺癌的誘因之一。此外，高動物脂肪飲食也與前列腺癌的發生有一定關系[1]。對前列腺癌的治療方法包括放射性粒子植入、根治性前列腺切除術、根治性外放射治療、內分泌治療和免疫治療等[2]。目前在癌癥治療中普遍采用的藥物在殺死癌細胞的同時也會對人體正常細胞產生較大毒副作用。因此，療效好且毒性低的抗癌藥物研究一直是癌癥治療研究領域的熱點和重要課題。其中，植物來源抗癌藥物的研究和開發是其重要組成部分。

以往我國臨床常用小檗堿治療胃腸道感染，近年研究[9,10，12，13]表明小檗堿能通過改善腸道菌群結構、加強腸道黏膜屏障和改善局部的慢性炎癥從而起到抗代謝紊亂的作用。此外小檗堿在腸道腫瘤防治中也表現出良好的效果。例如小檗堿可以減少宮頸癌細胞的轉移和血管生成[14]。在肝癌細胞中，小檗堿能夠通過下調血管內皮生長因子，從而抑制癌細胞血管生成，最終導致細胞死亡[15]。小檗堿可通過引起結腸癌細胞周期阻滯在G2/M期并誘導p21，從而引起細胞凋亡[16]。盡管目前對小檗堿抗癌的作用機制已經有了一定的研究，但是其具體途徑和機制尚未完全明確，尤其小檗堿在發揮抗癌作用中是否涉及細胞自噬過程并不清楚。因此，本研究觀察研究了不同濃度小檗堿對PC3前列腺癌細胞增殖的影響和可能機制。結果顯示，小檗堿對PC3前列腺癌細胞增殖具有明顯的抑制作用，且這種抑制作用具有濃度和時間依賴效應。

細胞凋亡是細胞死亡的一種形式[17]。Bcl-2家族在線粒體依賴的細胞凋亡途徑中起著重要的調控作用。該家族成員包括Bcl-2/Bax、Bcl-xl/Bcl-xs和Bak等，其中Bcl-2/Bax的作用尤為關鍵[4]。Bcl-2是一種抑制凋亡蛋白。Bcl-2可與Bax形成異源二聚體使其失活，并改變線粒體膜的通透性，促使細胞色素C的釋放。細胞色素C與Apaf-l和Caspase-9形成復合體，激活凋亡效應分子Caspase-3，最終引起細胞凋亡[5,6]。本研究結果顯示用75 μmol/L小檗堿處理PC3細胞48 h能夠引起PC3細胞產生顯著的凋亡現象。進一步的研究顯示，處理細胞中Bcl-2表達水平明顯下降，而Bax和Cleaved-Caspase-3表達量則明顯上調。這可能是由于小檗堿處理條件下，由于Bcl-2的下調和Bax的上調，導致細胞內Bax/Bax同源二聚體增多。進而調控線粒體PT孔的開放，釋放出細胞色素C。細胞色素C、Apaf-l和Caspase-9復合體剪切Caspase-3前體形成具有活性的Cleaved-Caspase-3，從而激活Caspase級聯反應促進細胞凋亡。

目前研究認為，自噬是區別于凋亡的另一條細胞死亡途徑。自噬和凋亡二者通路相互關聯，互為調控[18]。Bcl-2家族蛋白除參與到細胞凋亡之外還可對細胞自噬過程產生調節作用。Beclin1參與了自噬體的形成和成熟。Bcl-2能與Beclin1結合，從而抑制自噬的發生[19]。LC3是評價自噬活性的重要標記分子，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式。當形成自噬體時，LC3-Ⅰ與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ。直到自噬體與溶酶體結合后，LC3-Ⅱ才被其中的水解酶降解[7,8]。為了解本研究中Bcl-2表達量的下降是否會引起細胞自噬，因此進一步檢測了LC3的表達情況。結果顯示，在用小檗堿處理PC3細胞后，細胞中LC3表達量并無明顯變化，這表明小檗堿處理并沒有促進細胞內自噬體的形成。這可能是由于盡管細胞內Bcl-2表達水平有所下降，釋放出Beclin1。但是由于Caspase-3的激活，能夠剪切Beclin1從而抑制自噬的發生，因此無法促進自噬體的形成。

綜上所述，小檗堿能夠明顯抑制前列腺癌PC3細胞的增殖。其作用機制可能是通過下調Bcl-2的表達，上調Bax和Cleaved-Caspase-3的表達，從而激活線粒體依賴的細胞凋亡途徑。并且其中可能并不涉及自噬途徑。

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熊校勤(E-mail：jjing2003_1@163.com)

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R737.25

A

1002-266X(2016)27-0041-03

2016-02-19)