動物腦缺血性疾病治療中肌肽的給藥途徑、劑量、時間及其作用機制研究進展

馬茜，王辛，王愛紅

(1蘇州市中醫醫院，江蘇蘇州215001；2南京中醫藥大學護理學院)

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動物腦缺血性疾病治療中肌肽的給藥途徑、劑量、時間及其作用機制研究進展

馬茜1,2，王辛2，王愛紅2

(1蘇州市中醫醫院，江蘇蘇州215001；2南京中醫藥大學護理學院)

肌肽在腦缺血性疾病動物模型中的給途徑有腹腔注射、靜脈注射及口服，其治療時間窗為6～9 h，1 000 mg/kg和2 000 mg/kg肌肽腹腔注射具有腦保護作用，但低劑量(250、500和750 mg/kg)是否具有腦保護作用尚存在爭議。肌肽主要通過抗氧化、抗炎、抗凋亡、免疫調節及抗興奮性毒性作用等機制實現神經保護作用。

肌肽；腦缺血性疾病；給藥途徑；神經保護機制

肌肽是一種由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的內源性二肽[1]，廣泛分布在骨骼肌、腦、心臟、腎臟等組織器官中，以骨骼肌和大腦含量最多。肌肽具有抗氧化[2]、抗凋亡[3]、抗炎[4]、免疫調節[5]等作用，臨床已經用于癌癥、阿爾茲海默癥、老年性白內障、威爾遜氏病、糖尿病等疾病的治療。肌肽可穿透血腦屏障[3]，對腦缺血后神經細胞損傷的多種機制均有積極的調節作用，是治療腦缺血性疾病的有力候選藥物。很多神經保護劑在動物實驗中被證實對腦缺血疾病具有神經保護作用，但在臨床試驗中卻被驗證無效，目前對肌肽神經保護作用的研究也還停留在動物實驗階段，現將肌肽在腦缺血疾病動物模型中的給藥途徑、劑量、時間及其神經保護機制作一綜述，為進一步臨床試驗提供理論指導。

1　給藥途徑

目前，腹腔注射給藥是肌肽在腦缺血性疾病動物模型中最普遍的給藥途徑[5,6]，腹腔注射可增強腦缺血大鼠腦組織肌肽的免疫活性，可能與肌肽可直接穿透血腦屏障有關。另有研究[7]發現，靜脈注射1 000 mg/kg和2 000 mg/kg肌肽水溶液均對腦缺血大鼠具有神經修復作用。口服是肌肽的另一種給藥方式，肌肽可通過特殊的轉運系統被小腸絨毛刷狀緣吸收，通過腸黏膜載體擴散入血液并運送到腎臟、肝臟和肌肉中被外周組織利用，也可通過肌肽酶水解成丙氨酸和組氨酸供人體利用[8]。王愛紅等[9,10]也發現，肌肽水溶液灌胃可減輕腦缺血大鼠的神經功能受損程度，提高大鼠免疫能力。隋鑫[13]對肌肽在人工胃液和人工腸液的穩定性進行研究，結果發現肌肽在胃中可能不穩定，臨床應用時應將其制成口服腸溶制劑，同時微酸條件可促進肌肽的藥物吸收速度。

2　給藥劑量

肌肽在腦缺血性疾病動物模型中的給藥劑量尚無定論。Zhang等[6]腹腔注射100 mg/kg肌肽可減輕大鼠全腦缺血后腦組織氧化損傷程度。張香敏等[5]則認為腹腔注射250 mg/kg肌肽可明顯減輕腦缺血后的氧化應激反應，減少神經細胞凋亡。Bae等[7]研究表明，靜脈注射1 000 mg/kg和2 000 mg/kg肌肽均可縮小短暫性腦缺血大鼠腦梗死體積、改善神經功能缺損程度，但靜脈注射500 mg/kg肌肽無法縮小腦梗死體積。Wang等[3]也發現腹腔注射1 000 mg/kg肌肽可提高短暫性腦缺血大鼠腦組織 中轉錄激活蛋白3(STAT3)、Pim-1 mRNA及pSTAT3、Pim1、bcl-2蛋白的表達，最終降低Caspase-3的蛋白表達，抑制細胞凋亡，但500 mg/kg和750 mg/kg肌肽效果不明顯。綜上所述，肌肽的腦保護作用具有劑量效應性，1 000 mg/kg和2 000 mg/kg肌肽具有腦保護作用，但低劑量(250、500和750 mg/kg)是否具有腦保護作用尚存在爭議，可能與以往研究的給藥途徑及腦缺血性疾病動物模型類型不同有關。

3　給藥時間

肌肽對腦缺血損傷具有預防作用。隋鑫等[11]在制作小鼠永久性大腦中動脈缺血模型前30 min，給小鼠腹腔注射1 000 mg/kg肌肽，可明顯減小腦缺血后小鼠的腦梗死灶，改善神經功能，且效果可持續7 d。Nakase等[12]發現，術前30 min為短暫性腦缺血大鼠腹腔注射250 mg/kg肌肽，可發揮抗氧化和抗凋亡作用,這與Zhang等[6]的研究結果一致。肌肽對腦缺血性疾病后的腦損傷也具有治療作用，但其治療時間窗尚無定論。Bae等[7]研究顯示肌肽治療時間窗更長，針對短暫性腦缺血有效治療時間窗為6 h，針對永久性腦缺血有效治療時間窗為9 h，效果優于目前唯一的腦卒中溶栓劑-重組組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)的3～4.5 h治療時間窗。

4　作用機制

4.1抗氧化作用氧自由基損傷是腦缺血性疾病發生、發展的重要核心因素之一[12]。腦缺血性疾病后，線粒體被破壞，無法進行有氧氧化，氧化磷酸化水平降低，ATP產生不足，再灌注后血液中的氧只能和線粒體上的各種酶催化生成大量活性氧簇(ROS)，同時，抗氧化酶系統，如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)功能下降，導致體內自由基爆發，造成腦損傷。Stvolinsky等[13]在全腦缺血性疾病再灌注損傷模型中發現肌肽可改善線粒體功能，提高腦組織線粒體氧化磷酸化水平，增加能量合成，降低腦組織線粒體膜上肌酸激酶(CK)和酪氨酸羥化酶(TH)的活力，減少ROS的產生，這與申峰等[14]的研究結果一致。氧自由基造成腦損傷的主要機制之一為自由基容易攻擊含有不飽和脂肪酸的細胞生物膜，使細胞膜發生脂質過氧化，從而使生物膜通透性增加，最終造成細胞壞死。細胞膜的脂質過氧化被認為是腦缺血性疾病損傷的重要環節[15]，丙二醛(MDA)為主要的脂質過氧化物，其含量變化可以間接反映組織中氧自由基的含量及組織細胞的損傷程度[16]。

4.2抗炎作用肌肽可顯著提高腦缺血再灌注大鼠腦組織中熱休克蛋白70(HSP70)陽性細胞的表達[17]。HSP70是缺血性腦損傷所誘導的一種神經元保護性物質，被認為與缺血性腦損害的修復密切相關[18]。炎癥是誘導熱休克蛋白產生的一個應激因素，而腦缺血性疾病后強烈的炎癥反應是造成腦組織繼發性損傷的因素之一，炎癥介質在這一過程中發揮重要作用。缺血刺激損傷區免疫細胞活化并釋放炎性介質，造成腦組織損傷，炎性介質又可招募循環中的中性粒細胞、單核/巨噬細胞進入腦缺血性疾病損傷區產生更多的炎性介質，包括細胞因子、趨化因子和損傷相關效應分子，加重炎性反應[19]。

另外，MMPs是鋅依賴的一類蛋白水解酶，存在于細胞外基質中，可破壞血-腦屏障，使炎性細胞進入大腦[20]，促進炎癥反應，加重腦損傷。而MMP-9是MMPs家族重要成員，在腦梗死的發生發展中起重要作用[21]。Denes等[19]在研究肌肽對小鼠永久性腦缺血損傷的影響時發現，肌肽可明顯減小腦梗死體積，抑制大腦中MMP-9活性和蛋白水平，提示肌肽可通過抑制腦缺血過程中MMP-9的釋放，從而維持血腦屏障的完整性，減輕腦組織炎性損傷。

4.3抗凋亡作用腦缺血幾小時內，缺血半暗帶或梗死區周圍的神經元死亡主要以可逆性的凋亡為主，因此，抑制缺血半暗帶神經細胞凋亡可以成為腦缺血性疾病治療的重要手段。腦缺血后介導凋亡的通路主要為Caspase依賴的凋亡通路。在此凋亡通路中，有很多凋亡相關蛋白參與。其中，信號轉導蛋白及STAT3是一種轉錄因子和細胞內傳感器，腦缺血后，STAT3被激活，轉移至細胞核，轉化成pSTAT3，許多蛋白均由pSTAT3調控，其中，Pim-1是絲氨酸/蘇氨酸激酶質子家族的一員，STAT3可以激活Pim-1的基因轉導過程。

除了Caspase依賴凋亡途徑，非Caspase依賴途徑也可誘導細胞凋亡。細胞凋亡誘導因子(AIF)在非caspase依賴的細胞死亡調節中起著關鍵作用。當腦缺血性疾病缺氧后，由于氧化應激刺激，線粒體內膜的通透轉換孔打開，導致線粒體外膜破裂，AIF釋放入胞漿，直接進入細胞核，促進核染色質濃縮和DNA大片段化[22]。而肌肽預處理可抑制腦缺血性疾病大鼠腦組織海馬區AIF的基因和蛋白表達，減少腦缺血缺氧后神經細胞凋亡[5]。

4.4免疫調節作用缺血后繼發性腦損傷激發了一系列免疫級聯反應，引起了嚴重的外周免疫抑制，造成感染，增加腦卒中后的致殘率和致死率。在這一過程中，快速的T淋巴細胞減少是主要表現[23]，T淋巴細胞亞群的數量和活性是細胞免疫功能的直接反映，在細胞免疫中發揮重要的調節作用，主要由CD3+、CD4+、CD8+輔助性T淋巴細胞和殺傷性T細胞等主導，CD4+/CD8+值能初步評估機體免疫狀態，比值下降，提示免疫功能受損，是機體病變程度和預后不良的重要標志之一；比值增加，提示免疫應答的正調節占優勢[24,25]。王愛紅等[9]的研究顯示，肌肽治療可明顯減輕永久性腦缺血大鼠神經功能缺損，減小腦梗死體積，提高外周血CD3+、CD4+細胞水平及CD4+/CD8+，可見肌肽對可調節腦缺血大鼠外周血T淋巴細胞水平，改善腦缺血后外周免疫抑制狀態，并發揮腦保護作用。

CD4+Th細胞分為Th1和Th2兩個亞群，Th1細胞主要產生促炎性細胞因子IFN-γ、IL-2等，Th2細胞主要分泌抗炎性細胞因子IL-4、IL-6等，細胞因子表達從Th1向Th2漂移是腦缺血后免疫抑制的另一個表現。而肌肽可逆轉Th1和Th2之間的失衡，增加腦缺血大鼠外周血IFN-γ的水平，降低IL-4水平，改善免疫抑制狀態[12]。

4.5抗興奮性氨基酸毒性在缺血過程中能量快速耗竭引起細胞內外離子濃度差的失衡以及神經元、膠質細胞膜電位的下降，缺血區細胞外液中興奮性氨基酸(尤其是谷氨酸)顯著上升，造成N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)等谷氨酸受體大量激活。由于NMDA受體對Ca2+具有高度通透性，當其被大量激活后引起大量的Ca2+內流，產生興奮性毒性[26]。沈耀等[27]報道，NMDA可造成與神經元在形態、生理、生化等方面接近的PC12細胞死亡，而肌肽預處理可顯著提高細胞的存活率，其神經保護作用與其能提高細胞內外組氨酸和組胺含量有關。

綜上所述，肌肽在腦缺血性疾病動物模型中可通過抗氧化、抗炎、抗凋亡、免疫調節及抗興奮性毒性作用等機制實現神經保護作用。其主要給途徑包括腹腔注射、靜脈注射及口服，治療時間窗較長，與rtPA相比，具有明顯優勢。1 000 mg/kg和2 000 mg/kg肌肽具有腦保護作用，但低劑量(250、500、750 mg/kg)是否具有腦保護作用尚存在爭議，仍需進一步實驗證實，而且，目前肌肽在腦缺血治療方面的研究仍然停留在動物實驗階段，對于臨床腦缺血疾病的治療效果及其機制仍未闡明，應加強其臨床應用研究。

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教育部人文社項目基金立項(1318)。

王愛紅(E-mail: 370010@njucm.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.037

R743

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1002-266X(2016)27-0104-03

2015-12-01)