循環(huán)腫瘤細胞在原發(fā)性肝癌診斷、預后及療效評價中的應用進展

劉子鑫，石潔，李楠，郭衛(wèi)星，程凱，孫居仙，劉善榮，程樹群

(第二軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院，上海200438)

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循環(huán)腫瘤細胞在原發(fā)性肝癌診斷、預后及療效評價中的應用進展

劉子鑫，石潔，李楠，郭衛(wèi)星，程凱，孫居仙，劉善榮，程樹群

(第二軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院，上海200438)

循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)是指自發(fā)或者因診療操作自腫瘤原發(fā)灶脫落，進入血液循環(huán)的腫瘤細胞，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。目前臨床常用的外周血CTCs的分離和檢測方法主要有聯(lián)合磁珠分離CD45+(CTCs檢出率50%)、ISET方法(CTCs檢出率50%)、密度梯度離心、EpCAM聯(lián)合CD45磁珠分離法(CTCs檢出率53.9%～92.9%)、體內(nèi)流式細胞術(CTCs檢出率60.7%)、cellsearch聯(lián)合免疫熒光染色(CTCs檢出率30.5%)等。CTCs“液態(tài)活檢”在PLC的早期診斷中具有重要價值，且CTCs計數(shù)與PLC多灶性、門靜脈癌栓的形成及患者肝功能Child-Pugh分級密切相關。外周血CTCs數(shù)與PLC患者的預后密切相關，CTCs計數(shù)越多，患者預后越差。治療前后外周血CTCs數(shù)量變化可評價PLC的治療效果。

循環(huán)腫瘤細胞；原發(fā)性肝癌；臨床應用

原發(fā)性肝癌(PLC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，病死率居常見惡性腫瘤病死率的第3位[1]。PLC起病隱匿，發(fā)展迅速，惡性程度高，早期臨床表現(xiàn)為肝區(qū)疼痛和惡心、食欲減退、腹脹、腹瀉等消化道癥狀；且PLC細胞具有較強的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，病情早期即可侵犯血管、出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移[2]。因此早診斷、早治療對于PLC患者的預后具有重要意義[3]。目前臨床認為的循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)除了包括自發(fā)自腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移病灶脫落進入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞外，還包括在診療操作中造成的腫瘤細胞脫落而進入血循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞[4]。由于其來源的特殊性，在腫瘤患者外周血中檢測到的CTCs可能從某種程度上反應患者體內(nèi)腫瘤細胞的特性，從而為臨床監(jiān)測腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移、腫瘤的個體化治療、判定腫瘤患者的預后提供依據(jù)[5]。本文就CTCs在PLC診斷、預后及療效評價中的應用研究進展綜述如下。

1　外周血CTCs的分離和檢測方法

理想的分離檢測CTCs的平臺具有以下幾個特征[6]：①能檢測能夠檢測到每一個癌癥患者樣品血中的每個CTCs,同時在健康對照的樣品中沒有假陽性的出現(xiàn)；②高純度,分離的CTCs不能混雜其他正常細胞；③能夠保持分離得到的CTCs的活性、形態(tài)正常、蛋白核酸穩(wěn)定，以便開展后續(xù)的實驗研究和臨床特性的獲得；④廉價、高產(chǎn)出、快捷，以便臨床推廣；⑤結(jié)果穩(wěn)定，可重復。到目前為止，相比于乳腺癌和結(jié)腸癌，僅有少數(shù)學者對PLC中CTCs的檢測和定量方法進行了研究[7～16]。Stott等[7,8]采用流式分選后裸鼠皮下種植的方法，CTCs檢出率30%；有學者[9，10]采用聯(lián)合磁珠分離CD45+細胞的方法分離CTCs，CTCs檢出率高達53%；Guo等[11，12]采用ISET方法分離檢測了44例患者的外周血CTCs，檢出率為52.3%；Xu等[13]采用密度梯度離心、EpCAM、CD45磁珠分離等方法，CTCs檢出率53.9%～92.9%；Liu等[14]采用體內(nèi)流式細胞術檢測肝癌患者外周血CTCs的動態(tài)變化，與傳統(tǒng)流式敏感性相比提高1.8倍；有學者[15,16]分別采用cellsaerch系統(tǒng)、cellsearch聯(lián)合免疫熒光染色檢測肝癌患者外周血CTCs，CTCs檢出率分別為66.7%、30.5%。這些研究采取的研究材料均不同，有直接采用患者抽靜脈血，有應用細胞系或小鼠動物模型；同時，受限于工藝差別以及各自不同的研究背景，這些報道所采用的CTC富集和檢測的方法不一樣，得到的結(jié)果也各有差異。

2　CTCs在PLC診斷中的應用

CTCs直接來源于腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶，其計數(shù)和分子特征的鑒定可在一定程度上反映腫瘤的特性，因此，CTCs可以作為一種新興的腫瘤標記物來對腫瘤的診斷、轉(zhuǎn)移、預后以及治療反應進行實時檢測。由于其檢測對象為外周血，無需通過有創(chuàng)手段來對實體腫瘤進行取材就可以進行病理學檢查，這種檢測方式被稱作是“液態(tài)活檢”[17]。Yang等[12]運用流式細胞技術檢測CD45-CD90+細胞在肝癌患者血液樣品中的分布情況,CTC檢出率高達90%，而在對照肝硬化患者、健康體檢者的血液中均未檢出CTC。說明CTCs“液態(tài)活檢”在PLC的早期診斷中具有重要價值，當腫瘤原發(fā)灶不能被傳統(tǒng)的檢測手段檢測到時，可以通過外周血檢測CTCs來提前預測腫瘤的發(fā)生，為PLC的早期介入治療提供依據(jù)，提高PLC的治療效果。

3　CTCs在PLC預后評價中的應用

既往研究認為，腫瘤患者外周血中出現(xiàn)CTCs，預示著預后不良，且CTCs計數(shù)更是與腫瘤預后密切相關[18]。Liu等[14,16]研究發(fā)現(xiàn)，用cell-search系統(tǒng)檢測的肝癌患者外周血CTCs數(shù)與肝預后密切相關，提示術后腫瘤復發(fā)風險高、患者生存率低。Vona等[10]研究發(fā)現(xiàn)外周血CTCs≥4個的肝癌患者生存期明顯短于外周血未見CTCs者。Schulze等[16]也利用cell-search系統(tǒng)檢測59例HCC患者外周血中EpCAM+細胞。他們發(fā)現(xiàn)CTC計數(shù)與HCC患者的總體生存期、BCLC分期、血管侵犯和肝癌特異性標記物AFP強相關。

4　CTCs在PLC療效評價中的應用

大量研究已經(jīng)證實，在肝癌切除或者肝移植前就有CTC進入循環(huán)系統(tǒng)，他們可能逃逸免疫系統(tǒng)的殺傷而在患者體內(nèi)潛伏，它們以休眠的狀態(tài)隱匿于患者體內(nèi)，在某些因素的激發(fā)下，它們可以被激活而重新增殖，并遷移到靶器官，從而導致肝外轉(zhuǎn)移或者肝內(nèi)復發(fā)，這也被廣泛認為是轉(zhuǎn)移復發(fā)的重要一步[14,18]。并且這一現(xiàn)象或許增加肝癌切除或肝移植術后復發(fā)的風險，從而顯著降低術后無復發(fā)生存率。為提高肝臟移植術后的無病生存期，Toso等[19]調(diào)整免疫狀態(tài)，以通過免疫介導清除CTCs，達到降低CTCs的數(shù)量。當病灶不能被現(xiàn)有的檢測手段檢測到時，我們沒有一個可靠的指標和靶點來指導這一階段的治療，這樣可能錯過了一個癌癥治療的關鍵的有效時期。而由于CTCs的特殊來源，即使是很小的病灶(<1 mm)或者在腫瘤尚未在體內(nèi)形成原發(fā)灶時，我們就可以在血液中查到腫瘤細胞，因此循環(huán)腫瘤細胞可能作為一個指導此時期臨床治療的指標或者其本身可以作為治療的靶點。有研究已經(jīng)證實，治療前后CTCs的數(shù)量上的變化可以反映腫瘤對治療的敏感性以及增殖活性[20,21]。

CTCs作為一種腫瘤標記物出現(xiàn)，由于其特殊的來源，可以作為潛在的臨床應用指標，近幾年對其研究出現(xiàn)高潮[22]。同時，也由于其自身的特性使其在臨床推廣中也遇到困難。首先，由于腫瘤的“上皮-內(nèi)皮轉(zhuǎn)變”(EMT)現(xiàn)象，CTCs的異質(zhì)性較高，從而缺少一個高度特異的生物標記[23]。其次，除了由于其高異質(zhì)性和缺少特異性標記外，其數(shù)目相對較少也使得分離和檢測技術更加困難。每106～107個單核細胞中才有一個CTC，這使得其分離更加困難，準確性也不容易保證[24]。

綜上所述，循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)是指自發(fā)或者因診療操作自腫瘤原發(fā)灶脫落，進入血液循環(huán)的腫瘤細胞，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。目前臨床常用的外周血CTCs的分離和檢測方法主要有聯(lián)合磁珠分離CD45+(CTCs檢出率50%)、ISET方法(CTCs檢出率50%)、密度梯度離心、EpCAM聯(lián)合CD45磁珠分離法(CTCs檢出率53.9%～92.9%)、體內(nèi)流式細胞術(CTCs檢出率60.7%)、cellsearch聯(lián)合免疫熒光染色(CTCs檢出率30.5%)等。CTCs“液態(tài)活檢”在PLC的早期診斷中具有重要價值，且CTCs計數(shù)與PLC多灶性、門靜脈癌栓的形成及患者肝功能Child-Pugh分級密切相關。外周血CTCs數(shù)與PLC患者的預后密切相關，CTCs計數(shù)越多，患者預后越差。治療前后外周血CTCs數(shù)量變化可評價PLC的治療效果。盡管目前CTCs的臨床應用尚未普及，隨材料學和組織學的發(fā)展、CTCs分離技術不斷提高，CTCs在PLC診斷、預后及療效評價中具有廣闊應用前景。

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程樹群(E-mail: chengshuqun@aliyun.com)

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