水飛薊賓膠囊對酒精性肝纖維化大鼠的保護作用

黃 靜， 龍子江， 李 麗， 陸松俠

（安徽中醫藥大學，安徽合肥230038）

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水飛薊賓膠囊對酒精性肝纖維化大鼠的保護作用

黃 靜， 龍子江*， 李 麗， 陸松俠

（安徽中醫藥大學，安徽合肥230038）

摘要:目的 研究水飛薊賓膠囊對酒精性肝纖維化模型大鼠的保護作用并探討其作用機制。方法 取15只健康SD雄性大鼠作為正常對照組，85只大鼠采用灌胃乙醇混合液的方法復制酒精肝纖維化模型，將50只造模成功的的大鼠隨機分為模型組，水飛薊賓高、中、低劑量組和陽性藥組，灌胃給藥4周。末次給藥后取血清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定各組大鼠血清肝纖維化指標透明質酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、羥脯氨酸（HyP）、肝組織中Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（CⅣ）的含有量；用Western b1ot檢測大鼠肝組織WNT蛋白的表達量；用HE染色觀察各組肝組織病理學改變，Masson染色觀察各組肝纖維化程度。結果 與模型組比較，水飛薊賓高、中、低劑量組大鼠血清HA、LN、HyP、PCⅢ、CⅣ明顯降低（P＜0.01）；水飛薊賓高、中劑量組大鼠肝組織WNT蛋白表達量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），低劑量組降低不明顯（P＞0.05）；水飛薊賓組肝組織膠原纖維面積明顯減少，肝纖維化程度明顯改善。結論 水飛薊賓膠囊對酒精性肝纖維化有一定的治療作用，能顯著改善大鼠酒精性肝組織損傷，減輕肝纖維化。

關鍵詞:水飛薊賓膠囊；酒精性肝纖維化；透明質酸（HA）；層粘連蛋白（LN）；羥脯氨酸（HyP）；Ⅲ型前膠原（PCⅢ）；Ⅳ型膠原（CⅣ）；WNT蛋白

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.001

KEY W 0RDS: Si1ybin CaPsu1es；a1coho1ic 1iver fibrosis；hya1uronic acid（HA）；1aminin（LN）；hydroxyPro-1ine（HyP）；Proco11agen tyPeⅢ（PCⅢ）；co11agen tyPeⅣ（CⅣ）；WNT Protein

酒精性肝?。╝1coho1ic 1iver disease，ALD）是一種常見的慢性肝病之一，隨著社會現代化程度的不斷提高，其發病率逐年升高。ALD的發病機制尚未完全清楚，其在不同階段有不同的發病機制，過度飲酒則被認為是導致酒精性肝病重要原因之一［1］。ALD分為輕度酒精性肝病（MAI）、酒精性脂肪肝（AFL）、酒精性肝炎（AH）、酒精性肝纖維化（ALF）和酒精性肝硬化（AC），可發展至肝細胞癌（HCC）［2］。遺傳和非遺傳因素與個體易感性和ALD的進程有關。其中肝纖維化是肝臟對慢性損傷的一種修復反應，是指由各種致病因子所致肝內結締組織異常增生，導致肝內彌漫性細胞外基質（extrace11u1armatrix，ECM）過度沉淀的病理過程，是多種慢性肝病發展的共同病理基礎［3］，是發展到酒精性肝硬化的重要階段［4］。肝纖維化是一種動態病理過程，屬于可逆性病變［5-6］，而肝硬化一旦發生，損傷則不可逆，將嚴重危及人們的生命安全。因此，阻斷肝纖維化的發生和發展，對防治肝硬化和慢性肝病具有重要意義。

Wnt信號通路在器官的生成、再生及分化中發揮重要作用。在肝細胞、膽管細胞、肝星狀細胞和肝竇內皮細胞表面存在不同Wnt基因及相應受體基因的表達。Wnt信號通路通過調節細胞的再生與分化，參與肝臟的病理和生理作用，WNT蛋白的異常表達參與了肝內炎癥反應，肝內脂代謝異常及肝內氧化應激等，導致酒精性脂肪肝及肝纖維化等慢性肝病的發生。水飛薊素是傳統的肝臟疾病輔助治療藥物，是上世紀60年代末從菊科植物水飛薊種子的種皮中提取得到的有效成分。水飛薊素包括水飛薊賓、水飛薊寧、異水飛薊賓等，其中，以水飛薊賓的量最高，保肝活性也最強［7］。水飛薊賓作為傳統的保肝藥物，療效確切，在肝病治療領域得到廣泛的應用，常用于肝病的輔助治療及肝纖維化的治療用藥。本實驗通過觀察酒精肝纖維化模型大鼠血清透明質酸（hya1uronic acid，HA）、層粘連蛋白（1aminin，LN）、羥脯氨酸（hydroxyPro1ine，HyP）、肝組織Ⅲ型前膠原（Proco11agen tyPeⅢ，PCⅢ）、Ⅳ型膠原（co11agen tyPeⅣ，CⅣ）、肝組織形態學以及WNT蛋白相對表達量的改變，旨在探討水飛薊賓膠囊對酒精性肝纖維化損傷的保護作用及作用機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 100只健康SD（SPrague-Daw1ey）大鼠，雄性，SPF級，體質量180～220 g，由安徽省動物中心提供，動物許可證號SCXK（皖）2011-002。

1.2 實驗藥品與試劑 藥品:水飛薊賓膠囊（天士力制藥集團股份有限公司，批號130404）；秋水仙堿（西雙版納版納藥業有限責任公司，批號140507）。試劑: HA、LN、HyP、PCⅢ、CⅣ試劑盒，均購自南京建成科技有限公司，批號分別為E-30400、E-149004、E-30190、E-31035、E-30177。吡唑（批號2060171）購自美國Sigma公司；玉米油；56度紅星二鍋頭；豬油（自制）；膽固醇，由合肥博美生物科技有限公司提供。WNT兔多克隆抗（美國Biowor1d公司）；β-Actin鼠抗（美國Santa Cruz公司）；山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG均購自北京中杉生物技術有限公司；PVDF膜購自美國Mi11iPore公司；ECL超敏發光試劑盒為美國Thermo公司產品。

1.3 主要儀器 RT-6000酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；RT-3100型全自動洗板機（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；LeicaRM2016輪轉式切片機，購自上海五相儀器儀表有限公司；O1ymPus BX5型光學顯微鏡（日本O1ymPus公司）。AF-10型自動制冰機，購自意大利Scotsman公司；EPS 300型電泳儀、VE-180型電泳槽、VE-186型轉膜儀均購自Tanon公司。

2 方法

2.1 酒精肝纖維化模型大鼠制備 參照曹芹芳［8］造模方法復制酒精肝纖維化模型。大鼠正常飼養1周后，85只鼠灌服白酒-玉米油-吡唑混合液［其中56度白酒5 g/（kg·d）、玉米油2 mL/（kg·d）、吡唑27.2 mg/（kg·d）］1 mL/100 g，每天1次，固定在上午8∶30～9∶30，自由飲水。給予高脂飼料（87.5％基礎飼料、10％豬油、2％膽固醇）飼養，連續16周后隨機抽取2只大鼠處死后測肝功能以及肝組織HE染色、Masson染色鏡檢，以確定造模成功。15只正常組大鼠灌胃等容量的蒸餾水，給予普通飼料。

2.2 動物分組及給藥 將模型復制成功大鼠隨機分為模型組，陽性對照組（秋水仙堿:臨床人日用劑量為3 mg，按體表面積折算，大鼠每日給藥量0.27 mg/kg），水飛薊賓高、中、低劑量組（臨床人日用劑量210 mg，同法折算得大鼠每日給藥75.6、37.8、18.9［相當于臨床人日用劑量］mg/kg），每組10只。藥物組連續灌胃給藥4周，正常組和模型組灌胃等容量蒸餾水同法操作，各組每日給藥1次。同時，藥物組和模型組繼續給予乙醇混合液灌胃及高脂飲食直至實驗結束。

3 指標檢測

3.1 大鼠血清HA、LN、HyP水平的測定 末次給藥1 h后，3.5％水合氯醛（1 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定各組大鼠血清HA、LN、HyP的量。檢測步驟按照各試劑盒說明書依法操作。

3.2 大鼠肝組織PCⅢ、CⅣ水平的測定 末次給藥1 h后，3.5％水合氯醛（1 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取右葉肝組織，稱重，加9倍體積的生理鹽水，在冰浴條件下機械勻漿制成10％的肝組織勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液，再用生理鹽水10倍稀釋成1％待測，按照各試劑盒說明書中依法操作，酶標儀檢測各指標濃度。

3.3 Western b1ot檢測大鼠肝組織WNT蛋白水平每組大鼠取3塊肝組織，每塊100 mg，加入RIPA細胞裂解液1 mL（內含1 mmo1/L苯甲基磺酰氟PMSF）進行裂解，12 000 r/min離心10 min，提取總蛋白，用10％聚丙酰烯胺凝膠分離蛋白。在收集的蛋白樣品中加入等量的2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱10 min，以充分變性蛋白。待樣品冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內。將預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和PVDF膜（預先在甲醇中浸泡3 min），浸入轉膜緩沖液中5 min。轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，漂洗5 min，以洗去膜上的轉膜液。加入Western封閉液（5％脫脂奶粉），在搖床上緩慢搖動，室溫封閉2 h。封閉后加一抗WNT（1∶500）或β-Actin （1∶1 000）于4℃孵育過夜，二抗（1∶10 000）室溫下孵育2 h，使用ECL發光試劑盒來檢測蛋白，采用Image J軟件進行圖片灰度值分析。

3.4 肝組織形態學觀察 末次給藥1 h后，用3.5％水合氯醛（1 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取各組大鼠肝臟，在肝右葉同一部位取2塊約1 cm×1 cm×0.5 cm肝組織，10％中性甲醛溶液固定，常規脫水、包埋、切片，厚度為4 μm，連續切片5張，分別進行HE染色和Masson染色，HE染色觀察肝組織的肝小葉結構、肝索排列、炎性細胞浸潤程度，Masson染色觀察纖維化區域及程度等。

4 數據分析

5 結果

5.1 水飛薊賓膠囊對酒精肝纖維化模型大鼠血清HA、LN、HyP水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清HA、LN、HyP水平顯著升高，具有顯著性差異（P＜0.01）；與模型組比較，水飛薊賓高、中、低劑量組血清中HA、LN、HyP的量降低，存在顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

表1　水飛薊賓膠囊對AL F模型大鼠血清HA、LN、Hy p水平的影響（±s，n=1 0）Tab.1 Effects of Sllybln Capsules on serum HA、LN、Hyp ln ALF model rats（±s，n=10）

表1　水飛薊賓膠囊對AL F模型大鼠血清HA、LN、Hy p水平的影響（±s，n=1 0）Tab.1 Effects of Sllybln Capsules on serum HA、LN、Hyp ln ALF model rats（±s，n=10）

注:與正常組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05

組別　　劑量/（mg·kg-1）　HA/（ng·L-1）　LN/（μg·L-1）　HyP/（μg·L-1）正常組212.11±33.38　272.93±31.20　1 078.16±116.44模型組　-　294.76±46.72**　391.96±60.00**　1 383.52±86.46**水飛薊賓高劑量組　75.6　249.99±20.18△　324.67±52.71△　1 180.19±183.60△△水飛薊賓中劑量組　37.8　248.09±24.01△　321.99±66.90△　1 235.24±203.48△水飛薊賓低劑量組　18.9　256.11±23.39△　332.03±38.79△　1 228.60±163.29△秋水仙堿組　0.27　252.15±25.54△　332.75±65.44△-1 314.53±172.93

5.2 水飛薊賓膠囊對酒精肝纖維化模型大鼠肝組織PCⅢ、CⅣ的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織PCⅢ、CⅣ水平顯著上升，差異均具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，水飛薊賓高、中、低劑量組和陽性組肝組織PCⅢ、CⅣ水平明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1　水飛薊賓膠囊對酒精肝纖維化模型大鼠肝組織PCⅢ、CⅣ水平的影響（±s，n=1 0）Flg.1 Effects of Sllybln Capsules on llver tlssue PCⅢ、CⅣln ALFmodel rats（±s，n=10）

5.3 水飛薊賓膠囊對酒精肝纖維化模型大鼠肝組織WNT蛋白表達的影響 Western b1ot檢測獲得的蛋白條帶見圖2左側，經軟件分析獲得相應灰度值，以β-Actin為內參，計算WNT蛋白表達相對值，見圖2右側。與正常組比較，模型組大鼠肝組織WNT蛋白表達水平顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，水飛薊賓高劑量組、陽性組大鼠肝組織WNT蛋白表達水平顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。水飛薊賓中劑量組大鼠肝組織WNT蛋白表達水平降低較明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05），低劑量組大鼠肝組織WNT蛋白表達水平降低不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2　We s t e r n b l o t檢測大鼠肝組織WNT蛋白表達水平Flg.2 Relatlve expresslon quantltles of llver tlssue WNT proteln by W estern blot

5.4 水飛薊賓膠囊對酒精肝纖維化模型大鼠肝組織形態學的影響

5.4.1 光鏡觀察 HE染色觀察，正常組大鼠肝組織結構清晰，肝細胞形態正常，大小均勻，細胞核清晰可見，肝索排列整齊呈放射狀，匯管區無纖維結締組織增生及炎性細胞浸潤，無脂肪變性及壞死（圖3A）。模型組大鼠肝組織正常結構被破壞，肝細胞腫脹、變性、壞死，伴大量水樣性變和脂肪變性，肝索排列紊亂，匯管區及中央靜脈可見大量的炎細胞浸潤，纖維結締組織增生，并向小葉內延伸，部分區域形成不完全性分割（圖3B）。與模型組比較，水飛薊賓高（圖3C）、中（圖3D）、低劑量組（圖3E），秋水仙堿組（圖3F）病理學改善明顯，肝組織破壞程度、肝細胞水腫及脂肪變性程度均較為減輕，肝細胞壞死亦減輕，匯管區結締組織增生不明顯，可見少量淋巴細胞浸潤和脂肪空泡。

圖3　水飛薊賓對酒精性肝纖維化模型大鼠肝組織形態學的影響（HE染色，×200）Flg.3 Effects of Sllybln Capsules on hlstomorphology change of llver tlssue of alcohol-lnduced llver flbrosls ln rats（HE staln lng，×200）

5.4.2 Masson染色對膠原纖維的觀察 Masson染色時膠原纖維被染為藍色，正常組大鼠肝組織中僅有少許膠原沉積，主要位于匯管區（圖4A）。模型組大鼠肝臟組織膠原纖維增生明顯，匯管區、中央靜脈及肝實質內有大量的膠原沉積，并進入肝小葉形成不完全間隔，顯示肝纖維化形成（圖4B）。與模型組比較，水飛薊賓高（圖4C）、中（圖4D）、低劑量組（圖4E），秋水仙堿組（圖4F）膠原沉積明顯減少。

圖4　各組肝細胞光鏡觀察（Ma s s o n染色，×4 0 0）Flg.4 Pathologlcal changes of hepatlc tlssues under the llghtm lcroscope ln each group（Masson trlchrome stalnlng，×400）

6 討論

ALD是由于長期過度飲酒而導致的肝臟損傷性疾病，由于嗜酒人數的劇增，ALD的發病率逐年增加，并呈年輕化的趨勢，嚴重威脅人類的生命和健康。ALF發生的主要機理為肝臟中肝星狀細胞（HSC）的活化、增殖致使細胞外基質（ECM）合成與降解失衡，導致細胞外基質在肝臟內過度沉積［9-10］，如不加以干預最終會形成肝硬化甚至是肝癌。ALF不是獨立的疾病，而是各種慢性肝病發展為肝硬化的共同病理基礎，因此，阻止肝纖維化的發展具有重要的臨床意義。

HA、LN、PCⅢ、CⅣ的水平是反映肝纖維化程度比較公認的指標［11］，也即臨床上最常檢測的肝纖四項，對肝纖維化的發生、發展以及評估具有重要的臨床意義和價值。HA是ECM的主要成分之一，主要由HSC合成，分布在結締組織中，肝纖維化早期血液中HA顯著增加，是反應肝纖維化最有價值的血清標志物［12］。正常肝臟間質含少量LN，在肝纖維化和肝硬化時，肌成纖維細胞增多，進一步大量合成和分泌膠原、LN等間質成分，最終形成完整的基底膜（肝竇毛細血管化）。PCⅢ水平的升高可以反映肝纖維化處于活動期，可反映Ⅲ型膠原的代謝以及纖維化程度，CⅣ的大量沉積可引起肝竇毛細血管化及匯管區纖維化。HyP是膠原蛋白所特有的氨基酸，測定HyP的量可衡量膠原總體水平，間接反映肝纖維化的程度［13］。因此HA、LN、PCⅢ、CⅣ、HyP可以從不同的角度反映肝纖維化的病變程度［14］。

WNT蛋白是一類富含半胱氨酸的糖蛋白家族，參與細胞的增殖、分化、遷移，調控器官的發育，WNT蛋白與細胞膜上的卷曲蛋白結合，誘發其下游一系列信號分子的表達，發揮生物學效應。經典的WNT信號途徑是指β-連鎖蛋白（β-catenin）參與的WNT/β-catenin信號通路，WNT蛋白與細胞膜表面的Frizz1ed和LRP家族受體結合，將信號傳給蓬亂蛋白Disheve11ed（Dsh），活化的Dsh抑制軸蛋白（Axin）、結腸腺瘤性息肉病蛋白（APC）、糖原合成激酶-3β（GSK-3β）三聚體組成的復合物的活性，使胞漿內β-catenin蛋白不能被磷酸化，積累的β-catenin與轉錄因子TCF/LEF結合，調節靶基因的表達。當沒有Wnt信號時，胞漿內βcatenin被GSK-3β磷酸化，后又被泛素化，最終被蛋白酶體降解。已有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路參與肝纖維化的形成，使肝星狀細胞活化并增值，從而引起肝纖維化［15］。

本實驗結果可見，利用酒精復制的肝纖維化模型大鼠血清中HA、LN、HyP及肝組織中PCⅢ、CⅣ的量明顯增加，應用水飛薊賓治療后均明顯降低，提示水飛薊賓具有減輕肝細胞損傷、抗肝纖維化的作用。Western b1ot檢測模型組大鼠肝組織WNT蛋白表達量顯著高于正常組，各用藥組WNT蛋白表達量顯著降低。HE染色及Masson染色顯示，模型組大鼠肝細胞排列紊亂，有大量的變性、壞死、炎細胞浸潤、脂肪空泡及纖維結締組織的增生，應用水飛薊賓進行干預后，肝血竇周圍膠原明顯減少，相鄰血竇間的纖維聯絡基本消失，證明其具有抑制和逆轉纖維化，保護肝細胞作用。綜上所述，水飛薊賓有可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路降低HA、LN、HyP、PCⅢ、CⅣ水平，促進肝纖維化恢復，對酒精肝纖維化模型大鼠有明顯的治療作用，為臨床治療酒精肝纖維化提供實驗依據。

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Protectlve effects of Sllybln Capsules on alcohol-lnduced hepatlc flbrosls ln rats

HUANG Jing， LONG Zi-jiang*， LILi， LU Song-xia
（Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei230038，China）

ABSTRACT:AIM To eva1uate the efficacy of Si1ybin CaPsu1es in the treatment of a1coho1-induced 1iver fibrosis in rats and the Possib1e mechanism.METH0DS Fifteen hea1thy ma1e SD rats were used as norma1 contro1 grouP；eighty-five rats receiving ethano1mixtureweremade a1coho1ic 1iver fibrosismode1s.Fifty ratswith successfu1 mode1swere random1y divided into themode1grouP，Si1ybin CaPsu1es high-，medium-and 1ow-dose grouPs，and Positive grouP.After successive administration for four weeks，serum was seParated and HA，LN，HyP，PCⅢ，and CⅣ1eve1sweremeasured by ELISA.The re1ative exPression quantity of 1iver tissueWNT Protein were determined by Western b1ot.Liver tissuemorPho1ogy wasmeasured by HE staining.HePatic fibrosis was eva1uated by Masson trichrome staining.RESULTS ComPared with the contro1 grouP，the Si1ybin-treated grouPs had 1ower 1eve1s of HA，LN，HyP，PCⅢ，and CⅣ（P＜0.01）.The re1ative exPression quantity ofWNTProtein significant-1y reduced in high-and midd1e-dose grouPs（P＜0.01，P＜0.05），whi1e the re1ative exPression quantity of WNT Protein non-significant1y reduced in the 1ow-dose grouP（P＞0.05）；co11agen fibers of the 1iverweremarked-1y decreased in Si1ybin-treated grouPs.HePatic fibrosiswas significant1y imProved in Si1ybin-treated grouPs.C0NCLUSI0 N Si1ybin CaPsu1es are effective in the treatment of a1coho1-induced 1iver fibrosis by attenuating hePatic injury and fibrosis.

*通信作者:龍子江（1957—），男，碩士，教授，從事中藥對心腦血管疾病防治作用的研究。Te1:（0551）5169216，E-mai1: 1zjy1s@ 163.com

作者簡介:黃 靜（1984—），女，碩士生，從事中藥的藥理作用及對疾病防治作用的研究。Te1: 15256061620，E-mai1: huangjing_ 0214@163.com

收稿日期:2015-06-12

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0229-06