百里醌調控M 2型巨噬細胞表型極化的機制研究

徐 元， 譚 希， 王原來， 謝思楠， 章丹丹

（上海中醫(yī)藥大學穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海201203）

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百里醌調控M 2型巨噬細胞表型極化的機制研究

徐 元， 譚 希， 王原來， 謝思楠， 章丹丹*

（上海中醫(yī)藥大學穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海201203）

摘要:目的 考察黑種草子中的活性成分百里醌（thymoquinone）對M2型巨噬細胞極化的調控機制。方法 利用白介素4（IL-4）誘導鼠源巨噬細胞為M2型巨噬細胞模型；MTT法觀察百里醌對細胞活力的影響；Trans-we11小室遷移實驗考察巨噬細胞造模前后自身遷移力的變化、對乳腺癌4T1細胞的遷移能力變化及百里醌干預的影響；qRT-PCR法考察百里醌對M2型巨噬細胞內精氨酸酶1（Arg1）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的影響；Western b1ot法考察百里醌對細胞內ARG1、iNOS蛋白及信號傳導與轉錄激活因子6（STAT6）信號通路的影響。結果 百里醌不僅抑制巨噬細胞向M2表型極化后自身遷移力的提高，也抑制M2型巨噬細胞促進乳腺癌4T1細胞的體外遷移加劇。百里醌呈劑量依賴性抑制Arg1同時提高iNOS的表達，降低STAT6蛋白的磷酸化水平。結論 百里醌逆轉巨噬細胞M2表型極化，部分通過抑制IL-4/STAT6信號通路的活化，調控Arg1/iNOS的表達消長而干預M2表型極化進程中巨噬細胞自身及其促乳腺癌細胞的體外遷移加速。

關鍵詞:黑種草子；百里醌；巨噬細胞；表型極化；精氨酸酶1（Arg1）；誘導型一氧化氮合酶（iNOS）；信號傳導與轉錄激活因子6（STAT6）；作用機制

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.002

KEY W 0RDS: Semen Nigellae；thymoquinone；macroPhage；PhenotyPe Po1arization；arginase 1（Arg1）；inducib1e nitric oxide synthase（iNOS）；STAT6；mechanism

腫瘤相關性炎癥（cancer re1ated inf1ammation，CRI）是腫瘤的第7新特征［1］，腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macroPhages，TAM）是聯(lián)系腫瘤和炎癥的關鍵細胞，也是CRI的主要效應細胞［2］。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞釋放趨化因子、細胞因子等信號，將巨噬細胞招募并誘導其向M2表型發(fā)生替代性活化，成為TAM，發(fā)揮其促進腫瘤轉移、侵襲和免疫逃逸的作用，其數(shù)量高低與多種腫瘤預后呈負相關［3］。尋找中藥來源的巨噬細胞表型調控劑，逆轉M2表型以破除腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)，預防腫瘤免疫逃逸和轉移，并重啟巨噬細胞M1表型的抗腫瘤功能，是腫瘤免疫治療中的熱點領域［4］。

黑種草子（Semen Nige11ae）為毛茛科植物瘤果黑種草（Nigella glandulifera Freyn et Sint.）的干燥成熟種子，為維吾爾族藥食同源的習用藥。其性味甘、辛、溫，有補腎健腦、通經(jīng)、通乳、利尿之功效［5］。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗菌等功效。我們前期對黑種草子不同組分進行初步研究［6］，發(fā)現(xiàn)總皂苷具有抗炎活性［7］，總黃酮可抑制乳腺癌4T1細胞增殖［8］。百里醌（thymoquinone，TQ）是黑種草子揮發(fā)油中的活性成分，具有抗腫瘤增殖和轉移等作用［9］，但對其調控M2型巨噬細胞極化的研究尚未見報道。本研究考察百里醌對M2型巨噬細胞表型極化的影響及其相關機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 百里醌購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度為99.6％；小鼠巨噬細胞株RAW264.7，乳腺癌4T1細胞購自美國ATCC公司；鼠源IL-4購自美國PeProtech公司；胎牛血清購自美國HyC1one公司；RPMI-1640培養(yǎng)基干粉購自美國Gibco公司；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、Trizo1RNA提取試劑、High-CaPacity cDNA Reverse TranscriPtion Kits購自美國Life Techno1ogies公司；Rea1MasterMix SYBR Green試劑盒購自美國羅氏；硝酸纖維素（NC）膜購自美國Whatman公司；預染蛋白Marker購自美國Progema公司；iNOS、ARG 1抗體購自美國Abcam公司；P-STAT6、T-STAT6、β-Actin購自美國Ce11 Signa1ing Techno1ogy公司；相應二抗購自美國Santa Cruz公司；ECL檢測試劑購自美國GE公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；引物由上海生物工程服務有限公司合成，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱（HEPA CLASS100，美國Thermo公司）；生物安全柜（De1ta series，Labconco，美國）；低溫高速離心機（EPPendorf Centrifuge 5810R，德國）；倒置顯微鏡（IX 71，O1ymPus，日本）；SPectra MAX190酶標儀（美國MD公司）；QB-9006恒溫微孔板快速振蕩器（海門市其林貝爾儀器有限公司）；細胞計數(shù)儀（XDS-500C，上海蔡康光學儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（7500 Fast System，美國APP1ied biosystems公司）；電泳儀（PowerPacTMHC，美國BIO-RAD公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon NIM2045，上海天能科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞株和乳腺癌4T1細胞株均培養(yǎng)于含10％的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于保持飽和濕度、5％ CO2培養(yǎng)箱中，在37℃恒溫的條件下培養(yǎng)。待細胞長至7～8成密度進行傳代，PBS清洗2次后，用0.25％的胰酶（含0.02％的EDTA）消化，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打并收集細胞懸液，800 r/min室溫離心3 min。加入含血清培養(yǎng)基吹打混勻細胞，按1∶3～1∶6的比例傳代培養(yǎng)。取10～15代的細胞用于實驗。

2.2 MTT法考察百里醌對細胞活力的影響 巨噬細胞懸液以每孔1×104/100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)過夜。百里醌采用12.5、25、50 μmo1/L劑量處理細胞。刺激維持24 h后，加入MTT（用PBS溶解為5 g/L）溶液20 μL，繼續(xù)37℃培養(yǎng)4 h，加入DMSO后置搖床上使其充分溶解搖勻后，用酶標儀讀取490 nm光吸收值A，計算百里醌各劑量處理組對細胞活力的影響。各處理組設置3孔重復，獨立實驗重復3次。各處理組的細胞活力以空白對照組為100％進行換算。

2.3 Trans-we11小室遷移法考察M2型巨噬細胞造模前后的遷移能力變化及百里醌干預的影響 收集處于細胞對數(shù)期的巨噬細胞，用無血清培養(yǎng)基調整細胞密度為1×106/mL，取細胞懸液與百里醌混合液100 μL，終濃度為10、20 μmo1/L，加入Transwe11小室上室，模型組和給藥組的24孔板下室加入IL-4，終質量濃度為60 ng/mL，遷移24 h。Trans-we11小室用多聚甲醛固定30 min，0.1％結晶紫染色30 min，用水小心沖洗，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞。400倍顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細胞，記數(shù)。獨立實驗重復3次。

2.4 Trans-we11小室遷移實驗考察M2型巨噬細胞對4T1遷移能力變化及百里醌干預的影響 收集處于細胞對數(shù)期的巨噬細胞，用10％ FBS培養(yǎng)基調整細胞密度為1×106/mL，24孔板下室加入細胞懸液500 μL，培養(yǎng)過夜，第2天換無血清培養(yǎng)基，百里醌（10、20 μmo1/L）預處理1 h后，加入終質量濃度為60 ng/mL的IL-4造模6 h，隨后在Trans-we11小室上室加入無血清培養(yǎng)基調整的細胞密度為1×106/mL的4T1細胞，體積均為100 μL，遷移24 h。遷移24 h后取出Trans-we11小室，用多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min，用水沖洗，用棉簽小心擦除上層未遷移細胞。400倍顯微鏡下隨機5個視野觀察細胞并計數(shù)。獨立實驗重復3次。

2.5 qRT-PCR考察百里醌對M2型巨噬細胞中基因表達的影響 RAW264.7細胞培養(yǎng)于30 mm細胞培養(yǎng)皿中，待貼壁后無血清處理16 h，百里醌（10、20 μmo1/L）預處理1 h，與60 ng/mL終質量濃度的IL-4共孵育6 h后，收集各組樣品提取RNA，根據(jù)260 nm吸收值計算出RNA水平，加水調整各組樣品RNA至0.5 μg/μL。所用RNA的A260/A280均在1.8～2.0之間。逆轉錄合成模板cDNA后，應用7500 Fast Rea1-Time PCR擴增儀進行PCR聚合酶鏈式反應。PCR反應條件: 95℃×10 min；50℃×2 min；95℃×15 s，60℃×60 s，40個循環(huán)。引物序列如下: Arg1正向為5'-CAGAAGAATGGAAGAGTCAG-3 '，反向為5 '-CAG ATATGCAGGGAGTCACC-3'；iNOS正向為5 '-GGAGCGAGTTGTGGATTGTC-3'，反向為5 '-GTGAGGGCTTGGCTGAGTGAG-3'；GaPdh正向為5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'；反向為5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。獨立實驗重復3次。

2.6 Western b1ot法考察百里醌對M2型巨噬細胞中蛋白表達的影響 RAW264.7細胞培養(yǎng)于30 mm細胞培養(yǎng)皿中，待貼壁后無血清處理16 h，百里醌兩個劑量預處理1 h后，用60 ng/mL的IL-4共同作用6 h或30 min后，用冰PBS洗滌，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑后收集細胞，超聲破碎，離心（12 000 r/min，15 min，4℃），取蛋白上清液進行蛋白含量測定。每孔加入35 μg的蛋白上樣，在SDS-PAGE凝膠中電泳，蛋白轉移到NC膜上，脫脂牛奶或牛血清白蛋白（BSA）封閉，分別用一抗iNOS、ARG1、P-STAT6、T-STAT和β-Actin孵育過夜，經(jīng)洗膜、二抗孵育、洗膜后，最后ECL顯影。獨立實驗重復3次。

3實驗結果

3.1 MTT法考察百里醌對M0型巨噬細胞活力的影響 如圖1所示，百里醌在12.5～50 μmo1/L劑量對靜息態(tài)M0型巨噬細胞的細胞活力沒有影響，即不具有細胞毒性。

圖1　百里醌對靜息巨噬細胞活力的影響（n=3）Flg.1 Effects of TQ on restlng macrophage vlablllty （n=3）

3.2 Trans-we11小室遷移法考察M2型巨噬細胞造模前后的遷移能力變化及百里醌干預的影響 如圖2所示，利用IL-4造模后，巨噬細胞遷移能力顯著性提高（P＜0.01）。與模型組相比，百里醌呈劑量依賴性降低巨噬細胞誘導為M2表型后提高的體外遷移數(shù)量（P＜0.01）。

3.3 Trans-we11小室遷移法考察M2型巨噬細胞對乳腺癌4T1細胞的遷移力變化及百里醌干預的影響 如圖3所示，IL-4造模后的M2型巨噬細胞顯著性提高乳腺癌4T1細胞的體外遷移能力（P＜0.01）。百里醌呈劑量依賴性降低M2型巨噬細胞對乳腺癌4T1細胞的遷移能力的提升（P＜0.01）。

圖2　M 2型巨噬細胞造模前后的遷移能力變化及百里醌干預的影響（n=3）Flg.2 M lgratlon capablllty of M 2 macrophages and the lnterventlon of TQ（n=3）

圖3　M 2型巨噬細胞促乳腺癌4 T 1細胞的體外遷移及百里醌干預的影響（n=3）Flg.3 M lgratlon capablllty of 4T1 breast cancer cellsw lth M 2 macrophages and the lnterventlon of TQ（n=3）

3.4 百里醌對M2型巨噬細胞中Arg1和iNOS mRNA表達的影響 在M0型即靜息態(tài)巨噬細胞中，Arg1在基因水平低表達。經(jīng)IL-4（60 ng/mL）誘導6 h后，Arg1表達提高（P＜0.01），百里醌呈劑量依賴性下調Arg1的基因表達（P＜0.01）。見圖4。

圖4　百里醌對M2型巨噬細胞中A r g 1和i N 0 Sm RNA的影響（n=3）Flg.4 Effects of TQ on m RNA exp resslons of Arg1 and iN0S ln M 2 macrophages（n=3）

而巨噬細胞經(jīng)IL-4誘導后，iNOS的基因表達顯著下降（P＜0.05），百里醌呈劑量依賴性提高iNOS的基因表達（P＜0.01）。

3.5 Western b1ot法檢測百里醌對M2型巨噬細胞中ARG1、iNOS蛋白水平的影響 如圖5所示，在巨噬細胞向M2表型極化后，ARG1和iNOS的蛋白表達趨勢與基因表達一致（P＜0.01）。百里醌能抑制ARG1的蛋白表達，同時提升iNOS的蛋白表達（P＜0.01）。

注:與對照組比較，##P＜0.01，#P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05圖5　百里醌對M 2型巨噬細胞中ARG 1和l N 0 S蛋白水平的影響（n=3）Flg.5 Effects of TQ on proteln expresslons of ARG1 and lN0 S ln M 2 macrophages（n=3）

3.6 Western b1ot法檢測百里醌對STAT6蛋白磷酸化水平的影響 如圖6所示，在M0型巨噬細胞中，STAT6的蛋白磷酸化水平低，經(jīng)IL-4激活后，其磷酸化水平提高（P＜0.05）。百里醌呈劑量依賴性降低STAT6蛋白的磷酸化水平（P＜0.01）。

注:與對照組比較，##P＜0.01，#P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05圖6　百里醌對STAT 6蛋白磷酸化水平的影響（n=3）Flg.6 Effects of TQ on phosphorylatlon of STAT6（n=3）

4 討論

巨噬細胞具有異質性和多樣性，來自微環(huán)境不同信號可誘導其分化為不同的表型。M1型經(jīng)典性激活和M2型替代性激活是巨噬細胞表型極端化后的兩個主要亞群，在不同的生理和病理條件下發(fā)揮不同的生物功能。

在巨噬細胞極化過程中，Arg1與iNOS為一對競爭性酶，二者的表達和活性受到嚴格調控，兩者間的動態(tài)平衡在維持巨噬細胞的功能穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。Arg1為M2型巨噬細胞標志物，經(jīng)IL-4、IL-13等誘導后高表達，生成鳥氨酸和尿素，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)物質；而iNOS為M1型巨噬細胞標志物，在受到脂多糖（LPS）、干擾素γ（IFN-γ）等刺激下高表達，產(chǎn)生大量的一氧化氮，起殺傷腫瘤細胞的作用［10］。百里醌在干預M2型巨噬細胞極化中，抑制Arg1在基因和蛋白水平的表達，同時提高iNOS的表達，暗示著百里醌可逆轉M2表型，使巨噬細胞表型向M1型極化。

在M2型替代性活化進程中，IL-4與其受體結合，激活酪氨酸激酶（JAK）使酪氨酸殘基磷酸化，招募STAT6后從受體處分離，級聯(lián)活化后的復合物入核，與相應的靶基因啟動子結合，控制目的蛋白的表達［11］。百里醌可降低STAT6蛋白的磷酸化水平，使IL-4/STAT6介導M2表型極化的信號通路失活。

綜上所述，百里醌是黑種草子中逆轉巨噬細胞M2表型極化的活性成分，部分通過抑制IL-4/ STAT6信號通路的活化，調控Arg1/iNOS的表達消長而干預M2表型極化進程中巨噬細胞自身及其促乳腺癌細胞的體外遷移加劇。

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M echanlsm of thymoqulnone on regulatlon M 2 phenotype polarlzatlon ofmacrophages

XU Yuan， TAN Xi， WANG Yuan-1ai， XIE Si-nan， ZHANG Dan-dan*
（Murad Research Institute for Modernized Chinese Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

ABSTRACT:AIM To study themechanism of thymoquinone from Semen Nigellae on its regu1ation ofM2 PhenotyPe Po1arization ofmacroPhages in vitro.METH0DS IL-4（60 ng/mL）induced RAW264.7 ce11s to estab1ish the M2 macroPhagemode1.MTT assay was used tomeasure the ce11cytotoxicity of thymoquinone.Trans-we11assay was used formeasurement ofmigration caPabi1ity；qRT-PCR was used to determinemRNA exPression of Arg1 and iNOS.Western b1otwas used for Protein exPressions of ARG1，iNOS and PhosPhory1ation of STAT6.RESULTS Thymoquinone not on1y inhibited the increased migratory caPabi1ity ofmacroPhage towards M2 PhenotyPe，but a1so rePressed breast cancer ce11smigration with the aid of M2 macroPhages in vitro.Thymoquinone down-regu1ated the gene and Protein exPression of Arg1 whi1e uP-regu1ated the gene and Protein exPression of iNOS，and suPPressed the PhosPhory1ation of STAT6 Protein.C0NCLUSI0N Thymoquinone can reversemacroPhage Po1arization from M2 to M1 PhenotyPe and inhibits the Promotion of M2 macroPhages to breast cancer ce11smigration in vitro.IL-4/ STAT6 signa1Pathway is Part1y invo1ved to regu1ate the exPression between Arg1 and iNOS under the interference of thymoquinone.

*通信作者:章丹丹（1980—），女，博士，副研究員，主要從事腫瘤相關性炎癥的機制及中藥干預研究。Te1:（021）51322534，E-mai1: izhangdd@126.com

作者簡介:徐 元（1992—），女，碩士生，主要從事抗炎中藥篩選及相關機制的研究。Te1:（021）51322534，E-mai1: 2313390806@ qq.com

基金項目:上海市教育委員會科研創(chuàng)新項目（13YZ048）；國家自然科學基金項目（81573673，81001666）；上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題（20144Y0143）；上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師基金資助項目（SZY07029）

收稿日期:2015-06-15

中圖分類號:R966

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0235-06