九香蟲對染錳雄性大鼠生殖損傷的保護

何志全， 張 莉， 凌 蕾， 孫志誠， 侯曉暉

（遵義醫(yī)學院，貴州遵義563003）

?

九香蟲對染錳雄性大鼠生殖損傷的保護

何志全， 張 莉， 凌 蕾， 孫志誠， 侯曉暉*

（遵義醫(yī)學院，貴州遵義563003）

摘要:目的 探討九香蟲對生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠生殖功能的保護作用。方法 將35只8周齡的雄性SD大鼠隨機均分為5組，即模型組、空白組和九香蟲高、中、低劑量干預組。除空白組外，其余大鼠給予腹腔注射15 mg/kg MnC12·4H2O建立生殖損傷模型，九香蟲組飼料含高、中、低劑量的九香蟲，連續(xù)8周。觀察和檢測SD大鼠的生殖能力指標（性行為、大鼠精子數(shù)、睪丸和附睪的臟器系數(shù)、血清性激素水平）。結果 模型組的撲捉次數(shù)，射精能力，和精子數(shù)量較空白組和九香蟲中、低劑量干預組明顯下降；模型組睪丸、附睪臟器系數(shù)均顯著低于空白組和九香蟲高劑量干預組；模型組血清中睪酮水平均低于空白組和九香蟲干預組，而黃體生成素水平則高于空白組和九香蟲中劑量干預組。結論 中劑量的九香蟲對生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠生殖功能具有最佳保護功效果。

關鍵詞:九香蟲；錳染毒；生殖損傷；生殖保護

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.006

KEY W 0RDS: stik-bug（AsPongoPus chinensis）；exPosure to manganese；reProductive damage；reProductive Protection

九香蟲為昆蟲綱半翅目蝽科九香蟲（AsPongo-Pus chinensis）的干燥全蟲，主產(chǎn)于貴州、四川、云南等地，俗稱“屁板蟲”、“打屁蟲”、“屁巴蟲”。在民間，可作為中藥昆蟲和保健食品而廣泛食用，具有很高的藥用和食用價值，素有“有錢吃鹿茸，無錢吃打屁蟲”和“吃了屁巴蟲，滋補賽參茸，嚴冬不怕冷，夜間不尿床”等俗諺。《本草綱目》記載，該藥“氣味咸溫、無毒，主治膈脘滯氣、脾腎虧損、壯元陽”。《中國藥典》也記載其“歸肝脾腎經(jīng)，功能理氣止痛、溫中助陽，用于胃寒脹痛、脾胃氣痛、腎虛陽痿、腰膝酸痛”。研究證實［1-2］:九香蟲含有多種維持人體正常生理功能所必須的氨基酸、脂肪酸、維生素，微量元素（Fe、Zn）等營養(yǎng)物質，具有抗菌抑菌等藥理作用；其粗提物對于肝癌、胃癌細胞的體外生長亦有一定的抑制作用［3］；對治療遺精、陽痿、腎炎、胃痛、痛經(jīng)等有很好功效［4-9］。如此國藥瑰寶，若能通過現(xiàn)代醫(yī)學技術和方法證實其“溫中助陽”的功能，必將為其進一步開發(fā)為藥品或保健品提供實驗數(shù)據(jù)支持。迄今為止，國內外對九香蟲用于生殖系統(tǒng)損傷保護方面的研究尚未見報道，因此，本實驗設計了九香蟲干預生殖損傷實驗，通過檢測大鼠精子數(shù)、睪丸和附睪的臟器系數(shù)、血清性激素水平等指標反映九香蟲對生殖損傷的保護作用和功能水平改善，通過性行為觀察推斷九香蟲是否具有促進“溫中助陽”功效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 清潔級SD大鼠，8周齡，體質量（200±10）g，雄性和雌性各35只，購于重慶第三軍醫(yī)大學動物實驗室，許可證號: SCXK（渝）2012-0005。適養(yǎng)1周后用于實驗。

1.1.2 主要試劑 九香蟲若干（采自貴州省遵義市正安等縣），MnC12·4H2O（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司），NaC1（分析純，上海化學試劑總廠），總蛋白定量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3 飼料制備 九香蟲飼料的制備:將購于遵義醫(yī)學院動物實驗中心的普通飼料磨成粉后，加入質量分數(shù)為20％、10％、5％的九香蟲粉末，混勻，將其制成圓柱形，置于37℃烘箱中烘干，備用。

1.2 方法

1.2.1 染錳雄性大鼠生殖損傷模型建立 將35只雄性SD大鼠隨機分為模型組、空白組和九香蟲高、中、低劑量干預組，每組7只。通過腹腔注射15 mg/kg MnC12·4H2O，1次/d，每周5 d，連續(xù)8周，空白組同樣方式給予等量的生理鹽水，通過錳染毒制備生殖損傷模型［10］。

1.2.2 九香蟲干預實驗 生殖損傷模型建立后第2周（即造模開始第9周）進行了九香蟲干預實驗，為保證每只大鼠的攝食量一致，采取單籠飼養(yǎng)，每日每只飼喂30 g飼料，九香蟲高、中、低劑量干預組分別給予含九香蟲20％、10％、5％的飼料喂養(yǎng)，模型組、空白組給予不含九香蟲的飼料喂養(yǎng)，1次/d，7 d/周，連續(xù)8周。

1.2.3 生殖能力指標檢測

1.2.3.1 性行為觀察 發(fā)情雌鼠制備:通過手術方法，將35只雌性SD大鼠雙側卵巢切除，術后經(jīng)肌肉注射青霉素2 U/d，連續(xù)3 d。飼養(yǎng)2周后進行實驗，實驗前48 h肌注苯甲酸雌二醇200 μg/kg，合籠前4 h肌注2 mg/kg黃體酮，以獲得發(fā)情良好的雌鼠。

性行為觀察:晚上7點開始觀察，將雄性SD大鼠放入紅色燈光下的透明盒10 min后，再將發(fā)情的雌鼠放入，觀察到大鼠間互相接觸、嗅舔、外生殖器探測等，之后出現(xiàn)撲捉和射精行為，每只雄性SD大鼠觀察15 min。記錄撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)以及射精次數(shù)。

1.2.3.2 睪丸和附睪臟器系數(shù) 處死大鼠，摘取睪丸，迅速剝去周圍脂肪組織和結締組織后稱重，并按下列公式計算睪丸臟器系數(shù):睪丸臟器系數(shù)=（睪丸質量/體質量）×100％。附睪臟器系數(shù)計算方法同睪丸。

1.2.3.3 精子計數(shù)及每日精子生成量測定 精子計數(shù):取大鼠一側附睪，剪碎附睪尾，置于4 mL PBS緩沖液中，于37℃水浴箱中孵育15 min，制備精子混懸液，混勻，取出10 μL精子混懸液于另一盛有90 μL PBS的離心管中，混勻，取10 μL于血球細胞計數(shù)板上，在顯微鏡下數(shù)出5個中方格的總精子數(shù)n，則每mL精液中含有的精子數(shù)為n× 25/5×稀釋倍數(shù)（10）×104。

每日精子生成量（dai1y sPerm Production，DSP）測定:取睪丸組織精確稱重，移至加少量睪丸勻漿液（STM）勻漿管，在內切式組織勻漿器中勻漿，定容至25 mL。取10 μL勻漿液于血球計數(shù)板，在顯微鏡下數(shù)出5個中方格的總精子數(shù)n。每克睪丸中精子頭數(shù)=n×25/5×STM稀釋系數(shù)（25）×104÷組織質量；每日精子生成量=每克睪丸精子頭計數(shù)÷大鼠精子發(fā)生所需時間（6.1 d）。

1.2.3.4 血清中性激素測定 用ELISA法，按照試劑盒說明書的操作方法檢測各組雄性SD大鼠血清中的睪酮和黃體生成素。

2 結果

2.1 九香蟲對SD大鼠性行為的影響 表1顯示:空白組大鼠相對活躍，表現(xiàn)多動，興奮，而模型組則精神萎靡不振、少動，兩組之間的撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)以及射精次數(shù)有顯著性差異（P＜0.05），說明生殖系統(tǒng)損傷模型建立成功；九香蟲干預組與模型組比較，中、低劑量組大鼠撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)和射精次數(shù)明顯增多，差異顯著（P＜0.05），高劑量組的騎跨次數(shù)和插入次數(shù)明顯增多（P＜0.05），而撲捉次數(shù)和射精次數(shù)沒有顯著差異。可推斷飼喂一定劑量九香蟲對大鼠有改善性行為的功效，但過量飼喂九香蟲后改善功效出現(xiàn)下降趨勢。

表1　各組間大鼠性行為的比較（±s，n=7）Tab.1 Comparlson of rats sexual behavlor lnd lces（±s，n=7）

表1　各組間大鼠性行為的比較（±s，n=7）Tab.1 Comparlson of rats sexual behavlor lnd lces（±s，n=7）

注:與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別　　撲捉次數(shù)/次　　騎跨次數(shù)/次　　插入次數(shù)/次　　射精次數(shù)/次空白組81.67±13.32　38.33±5.51　32.00±1.73　30.00±3.46模型組　57.00±15.89*　20.60±4.04*　12.66±8.50*　14.42±8.22*九香蟲高劑量干預組　70.63±9.32　32.67±7.23△　28.00±7.00△　18.00±8.83九香蟲中劑量干預組　82.00±16.87△　33.80±8.58△　31.20±7.19△　28.00±9.31△九香蟲低劑量干預組　74.88±11.53△　33.00±8.99△　30.43±8.90△　29.00±6.16△

2.2 各組大鼠睪丸臟器系數(shù)、附睪臟器系數(shù) 表2顯示:模型組與空白組相比，臟器系數(shù)明顯下降，有顯著差異（P＜0.05），說明生殖系統(tǒng)損傷模型動物臟器發(fā)生了相應的萎縮。但九香蟲干預后，與模型組比較，高劑量組大鼠體質量及睪丸、附睪臟器系數(shù)顯著升高（P＜0.05），中劑量組體質量及睪丸臟器系數(shù)顯著升高（P＜0.05），低劑量組睪丸臟器系數(shù)顯著升高（P＜0.05）?？赏茢嗑畔阆x對大鼠的臟器有一定的保護功能，且與九香蟲劑量有一定的正相關。

表2　各組大鼠睪丸臟器系數(shù)、附睪臟器系數(shù)的比較（x± s，n=7）Tab.2 Comparlson of rats testls organ coefflclent，epldldym ls（±s，n=7）

表2　各組大鼠睪丸臟器系數(shù)、附睪臟器系數(shù)的比較（x± s，n=7）Tab.2 Comparlson of rats testls organ coefflclent，epldldym ls（±s，n=7）

注:與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別　　體質量/g 睪丸臟器系數(shù)　附睪臟器系數(shù)空白組431.60±32.31 0.95±0.05 0.39±0.11模型組　380.11±22.67*0.81±0.09*0.29±0.03*九香蟲高劑量干預組　423.10±52.08△0.96±0.04△　0.38±0.06△九香蟲中劑量干預組　422.29±23.14△0.95±0.12△0.34±0.03九香蟲低劑量干預組　407.74±28.43　 0.92±0.06△0.34±0.02

2.3 精子計數(shù)和每日精子生成量 表3顯示:模型組與空白組比較，精子數(shù)量和DSP都顯著下降（P＜0.05），說明生殖系統(tǒng)損傷模型大鼠精子發(fā)生出現(xiàn)了一定的障礙。九香蟲干預后，與模型組比較，中、高劑量組大鼠精子數(shù)量和DSP明顯增加（P＜0.05），低、中劑量組精子數(shù)顯著增加（P＜0.05）。可推斷九香蟲有助于精子發(fā)生，且與九香蟲劑量有一定的關聯(lián)。

表3　各組大鼠精子數(shù)量和每日精子生成量的比較（±s，n=7）Tab.3 Com parlson of rats sperm number and DSP（±s，n=7）

表3　各組大鼠精子數(shù)量和每日精子生成量的比較（±s，n=7）Tab.3 Com parlson of rats sperm number and DSP（±s，n=7）

注:與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別　　精子數(shù)/ （107·mL-1）精子頭計數(shù)/ （×106·g-1）每日精子生成量/ ［×106·（g·d）-1］2.47±0.50　 81.466±18.351　 13.355±3.008模型組　1.38±0.49*54.500±6.065*　8.934±0.994*九香蟲高劑量干預組1.91±0.56　 73.302±17.676△12.017±2.898△九香蟲中劑量干預組2.40±0.95△68.527±11.583△11.324±5.678△九香蟲低劑量干預組2.32±0.55△64.368±13.637　 10.552±空白組2.236

2.4 血清性激素睪酮(T)和黃體生成素(LH)的含有量測定結果 表4顯示:模型組與空白組相比，血清中的睪酮含有量降低，黃體生成素含有量升高，差異極顯著（P＜0.01），與已有報道一致。九香蟲干預組與模型組比較，血清中的睪酮水平升高，有顯著差異（P＜0.05）；中劑量組黃體生成素含有量下降，有顯著差異（P＜0.05），高、低

表4　各組大鼠血清睪酮和黃體生成素含有量測定結果的比較（±s，n=7）Tab.4 Com parlson of serum testosterone and lutelnlzlng rats results to determ lne plgment content（±s，n=7）

表4　各組大鼠血清睪酮和黃體生成素含有量測定結果的比較（±s，n=7）Tab.4 Com parlson of serum testosterone and lutelnlzlng rats results to determ lne plgment content（±s，n=7）

注:與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

組別　　睪酮/（ng·L-1）　黃體生成素/（ng·L-1）空白組98.17±3.49　19.39±1.21模型組　90.43±2.69**　23.56±1.60**九香蟲高劑量干預組　97.36±4.14△　20.82±2.43九香蟲中劑量干預組　97.27±3.31△　20.01±2.48△九香蟲低劑量干預組　97.08±4.33△21.94±0.96

劑量組無顯著差異。說明一定劑量的九香蟲有助于改善雄性大鼠的生精功能。

3 討論

近年來，隨著社會科技的發(fā)展、人們健康意識的加強及生殖醫(yī)學的發(fā)展，錳與生殖健康的關系越來越受到關注。研究證實［10-11］，錳暴露能引起包括生精細胞凋亡、睪丸生長發(fā)育與成熟延遲、精液濃度和精子活率降低、生精功能障礙等生殖系統(tǒng)損傷。而九香蟲在民間，可作為中藥昆蟲和保健食品而廣泛食用，具有很高的藥用和食用價值。研究也證實［1-2］，九香蟲含有多種維持人體正常生理功能所必須的氨基酸、脂肪酸、維生素，微量元素（Fe、Zn）等營養(yǎng)物質，是人體所需的重要營養(yǎng)成分，具有抗菌抑菌等藥理作用；其粗提物對于肝癌、胃癌細胞的體外生長亦有一定的抑制作用［3］，但對生殖系統(tǒng)損傷的生殖功能是否具有保護作用仍未得到證實。本實驗從動物的性行為、大鼠精子數(shù)、睪丸和附睪的臟器系數(shù)、血清性激素水平等生殖能力指標來分析判斷九香蟲對生殖系統(tǒng)的保護功效。

本研究結果可知:九香蟲干預生殖系統(tǒng)損傷的動物模型后，其大鼠相對活躍，表現(xiàn)多動，興奮，與模型組相比，中、低劑量組的撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)以及射精次數(shù)明顯增多（P＜0.05），其表現(xiàn)接近于空白組。可推斷九香蟲有改善大鼠性行為的功效。臟器系數(shù)是指實驗動物某臟器的質量與其體質量之比值。正常時各臟器與體質量的比值相對恒定，但動物染毒后隨受損臟器質量改變臟器系數(shù)也發(fā)生改變。因此，臟器系數(shù)的變化可反映在環(huán)境因素影響下臟器的增生、充血、水腫或萎縮等變化，是毒理實驗中常用的指標。表2結果顯示:九香蟲干預后，高劑量組的體質量及睪丸、附睪臟器系數(shù)均高于模型組（P＜0.05）。可推斷九香蟲對大鼠的臟器有一定的保護功能，且與九香蟲劑量有一定的正相關。精子數(shù)量和DSP是研究環(huán)境因素對男（雄）性生殖健康影響的重要觀察點之一，可有效判斷生殖毒性。表3顯示:九香蟲干預后，與模型組比較，低、中劑量組的精子數(shù)明顯增加（P＜0.05），中、高劑量組的精子頭數(shù)和DSP明顯增加（P＜0.05）。可推斷九香蟲有利于改善生精環(huán)境，有助于精子發(fā)生，且與九香蟲劑量有一定的關聯(lián)。血清中性激素水平是評價精子發(fā)生，了解睪丸組織結構特征的重要指標，可反映睪丸的生精功能。研究證實［12-13］:染錳可引起雄性動物血清中的睪酮含有量降低，黃體生成素含有量升高。我們實驗結果也表明:模型組與空白組相比，血清中的睪酮含有量降低，黃體生成素含有量升高，差異極顯著（P＜0.01），與已有報道一致。九香蟲干預后，與模型組比較，血清中的睪酮含有量明顯升高（P＜0.05）；中劑量組的黃體生成素明顯下降（P＜0.05）?？赏茢嗑畔阆x有助于改善激素調控水平，增強雄性大鼠的生精功能。但實驗結果同時也顯示，部分實驗數(shù)據(jù)出現(xiàn)高劑量組的保護效果不如低、中劑量組明顯的現(xiàn)象，可能是高劑量并非最佳的給藥劑量，九香蟲劑量過多其保護作用可能下降。因此，善需進一步摸索九香蟲的最佳保護劑量。

綜上所述，九香蟲干預生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠后，其各項生殖能力指標均有較明顯的改善，說明九香蟲對生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠生殖功能具有保護功效，且保護效果多以九香蟲高、中劑量干預組效果最佳，但其保護的作用機制仍不清楚，還有待下一步繼續(xù)研究。

參考文獻:

［1］ 李 俐，李曉飛.貴州九香蟲營養(yǎng)成分分析［J］.昆蟲知識，2010，47（4）: 748-751.

［2］ 孫遠明，余群力.食品營養(yǎng)學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2002: 65-82.

［3］ 侯曉暉，孫 廷，李曉飛.九香蟲粗提物對SGC-7901和HePG2細胞增殖及細胞周期的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（1）: 108-109.

［4］ 蘇勛莊.蟲類藥治療陽瘺［J］.中醫(yī)藥學報，1990（3）: 26-28.

［5］ 季柏新，程丑夫，張緒生，等.止痛靈的藥理研究［J］.湖南中醫(yī)學院學報，1990，10（3）: 157-159.

［6］ 王文仲，趙俊宏，周正華.溫養(yǎng)散結湯治療慢性萎縮性胃炎168例［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，1993，13 （12）: 721.

［7］ 李向榮，李從道.“胃糜散”治療糜爛性胃炎38例［J］.江蘇中醫(yī)，1994，15（11）: 6-7.

［8］ 鐘永楚.九香蟲的研究概況［J］.時珍國藥研究，1994，5 （2）: 42.

［9］ 劉慶芳.九香蟲現(xiàn)代臨床研究與應用［J］.河南大學學報:醫(yī)學科學版，2002，21（4）: 66-67.

［10］ 張先平，王乾興，才秀蓮，等.錳對大鼠睪丸抗氧化能力及生精細胞凋亡的影響研究［J］.中國計劃生育學雜志，2007，15（7）: 408-410.

［11］ 才秀蓮，李興升，李季蓉，等.錳對小鼠精子數(shù)量、畸形率和活動度影響［J］.中國公共衛(wèi)生，2007，23（1）: 104-105.

［12］ 才秀蓮，郭 海，伍冬梅.染錳大鼠血清和睪丸LDH活性的變化［J］.遵義醫(yī)學院學報，2010，33（2）: 101-103.

［13］ 才秀蓮，郭 海，伍冬梅，等.染錳大鼠生殖激素水平與生精細胞凋亡基因表達［J］.中國公共衛(wèi)生，2010，26 （8）: 1064-1065.

［臨 床］

Protectlon of stlnk-bug on manganese-lnduced reproductlve damage to male rats

HE Zhi-quan， ZHANG Li， LIN Lei， SUN Zhi-cheng， HOU Xiao-hui*
（ZunyiMedical College，Zunyi563003，China）

ABSTRACT:AIM To investigate the Protective effect of stink-bug（AsPongoPus chinensis）on the manganeseinduced reProductive damages toma1e rats.METH0DS Thirty-fivema1e eightweeks o1d SD ratswere random1y divided into five grouPs（n =7）: the mode1grouP，the b1ank grouP and stink-bug high-，medium-and 1ow-dose intervention grouPs.ExcePt the b1ank grouP，the rest of rats received intraPeritonea11y MnC12·4H2O（15 mg/kg）to create reProductive damaged mode1 rats.Stink-bug grouPswere fed on the fodderwith stink-bug for eightweeks. The rats' reProductive caPacity indices，inc1uding sexy activity，sPerm count，the organ coefficientof testis and eP-ididymis，and serum sex hormone 1eve1weremeasured.RESULTS ComPared with the b1ank grouP and stink-bug medium-and 1ow-dose grouPs，sexua1 behavior indexes inc1uding caPturing times，ejacu1ation abi1ity，and sPerm count in themode1grouP were 1ower；comPared with the b1ank grouP and stink-bug high dose grouP，the coefficient of testis and ePididymis viscera in themode1grouP was a1so 1ower.The serum testosterone 1eve1s in themode1grouP were 1ower than those of the b1ank grouP and stink-bug grouPs（P＜0.05）.But1uteinizing hormone 1eve1was higher than that of the b1ank grouP and stink-bugmedium grouP.C0NCLUSI0N Themedium-dose stink-bug is the best choice in terms of rePairing the reProductive damages ofma1e rats.

*通信作者:侯曉暉（1980—），女，博士，教授，主要從事生物學研究。E-mai1: 330539793@qq.com

作者簡介:何志全（1979—），男（瑤族），碩士，副教授，主要從事生殖發(fā)育研究。E-mai1: 17563239@qq.com

基金項目:貴州省“125計劃”重大科技專項（黔教合重大專項字［2014］031）；貴州省中醫(yī)藥管理局基金（QZYY2011-65）；貴州省級大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（201413653018）

收稿日期:2015-3-03

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0258-04