pH依賴型黃芩苷納米晶體結腸靶向微丸的制備及體外釋藥研究

程 玲， 鄭 娟， 沈 剛， 邱 玲， 李娟娟， 張利紅， 武 娜， 韓 晉，袁海龍 *

（1.成都中醫藥大學藥學院，四川成都611137；2.中國人民解放軍第302醫院，北京100039）

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pH依賴型黃芩苷納米晶體結腸靶向微丸的制備及體外釋藥研究

程 玲1，2， 鄭 娟1，2， 沈 剛1，2， 邱 玲1，2， 李娟娟1，2， 張利紅2， 武 娜2， 韓 晉2，袁海龍2 *

（1.成都中醫藥大學藥學院，四川成都611137；2.中國人民解放軍第302醫院，北京100039）

摘要:目的 制備PH依賴型黃芩苷納米晶體結腸靶向微丸，并對影響其體外釋藥行為的包衣處方進行優化。方法采用探頭超聲聯合高壓均質技術制備黃芩苷納米混懸劑，用流化床干燥法固化成納米晶體微丸，并考察其再分散后的粒徑、Zeta電位和多分散指數。然后，將上述納米晶體微丸進行流化床包衣，以微丸體外釋放度為評價指標，對包衣處方進行優化。結果 黃芩苷納米晶體微丸再分散后，平均粒徑為（281.90±10.56）nm，多分散指數（PI）為（0.195 1±0.043 2），Zeta電位為（-31.7±2.1）mV。最優包衣處方為以EudragitS100為包衣材料，8％的檸檬酸三乙酯（TEC）為增塑劑，50％的滑石粉為抗黏劑，包衣增重量為15％。所制得的黃芩苷納米晶體結腸靶向微丸在人工胃液2 h、小腸液4 h中的累積釋藥率小于13％，而在人工結腸液4 h中達93％。結論 該制劑具有良好的結腸靶向釋藥性能。

關鍵詞:黃芩苷；納米晶體；PH依賴；結腸靶向；體外釋放

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.014

KEY W 0RDS: baica1in；nanocrysta1；PH-dePendent；co1on targeting；re1ease in vitro

黃芩苷（baica1in）是唇形科植物黃芩的主要藥效成分，具有解熱、降壓、抗菌、保肝、抗腫瘤等作用［1］。現代研究證實，黃芩苷對實驗性結腸炎小鼠具有一定的保護作用［2-3］，其通過介導雷帕霉素靶蛋白（target of raPamycin，mTOR）信號通路的轉導來抑制人結腸癌細胞增殖［1］，但其水溶性差，體內溶出速率較低，限制了藥效的發揮。納米混懸劑為解決中藥難溶性成分溶解度差的問題提供了新的途徑［4］，岳鵬飛［4］、張秋菊［5］等采用不同制備工藝將黃芩苷制成納米制劑，使藥物的溶出顯著增強。針對黃芩苷對結腸部位疾病的確鑿療效，本實驗試圖將其納米制劑開發為口服結腸靶向制劑。

結腸靶向微丸是一種新型的口服給藥形式，因微丸表面修飾的差異，可實現時滯型、酶觸型、PH依賴型等釋藥特性，能有效地將藥物送至結腸病變部位，提高病灶部位藥物濃度，降低不良反應［6-7］。而且，微丸作為多劑量分散型給藥制劑，可避免片劑、膠囊劑受胃空速率的影響，即使個別微丸破損，也不會造成整個釋藥行為的改變，又因其體積小，與黏膜接觸面積大，可延長在結腸的滯留時間［7］，作為制劑中間體，能根據需要進一步制成其他劑型，應用范圍廣闊。

本實驗擬采用探頭超聲-高壓均質技術制備黃芩苷納米混懸劑，借用流化床技術，將其干燥固化為納米晶體微丸，表面再包以PH敏感型材料，以期實現結腸靶向和快速釋藥的目的，為黃芩苷結腸靶向制劑的研究提供參考。

1 材料與儀器

JHBE-20A探頭超聲儀（河南金鼐科技發展有限公司）；GYB40 -10S高壓均質機（上海華東高壓均質機廠）；NanoZS90粒徑分析儀（英國Ma1vern公司）；RC-3溶出度測試儀（天津市新天光技術平臺開發有限公司）；LC-20A島津液相色譜儀（日本島津公司）；流化床（MINI型，德國G1att公司）。

黃芩苷原料藥（批號110608，純度95％，陜西永健制藥有限公司）；黃芩苷對照品（批號110715 -201016，中國食品藥品檢定研究院）；Eudragit S100（批號B060303014，德國Deggusa公司）；藥用微丸丸芯（蔗糖型，杭州高成生物營養技術有限公司）；泊洛沙姆188（Po1oxamer-188）、聚維酮K30（PVP K30）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、檸檬酸三乙酯（TEC）、滑石粉（北京鳳禮精求商貿有限責任公司）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷納米晶體微丸的制備［8]分別稱取5％黃芩苷原料藥、0.25％十二烷基硫酸鈉、0.5％ Po1oxamer-188，置于適量的蒸餾水中，充分攪拌混勻，8 000 r/min探頭超聲10 min后，先在50 MPa條件下高壓乳勻10圈，再在100 MPa下繼續乳勻20圈，得到平均粒徑為（265.13±7.12）nm的黃芩苷納米混懸劑。將5％PVP K30黏合劑分別加到黃芩苷納米混懸劑和由上述處方組成的黃芩苷物理混合液中，取蔗糖空白丸芯適量，按進風溫度50℃，物料溫度33℃，進液體積流量1.0 mL/min，流化壓力0.029 MPa，霧化壓力0.157 MPa的工藝參數進行流化床上樣干燥，上樣完畢后，繼續干燥30 min，即得大小為（0.9±0.1）mm的黃芩苷納米晶體微丸和黃芩苷物理混合微丸，兩者含有量均為（6.5±0.3）％。

2.2 黃芩苷納米晶體微丸再分散后的粒徑測定［8]取黃芩苷納米晶體微丸適量，加蒸餾水振搖，直至出現黃色半透明狀，并且無可見大顆粒為止，再取適量稀釋至合適濃度，測定粒徑及Zeta電位。結果顯示，黃芩苷納米晶體微丸再分散后的平均粒徑為（281.90±10.56）nm，多分散指數（PI）為（0.195 1±0.043 2），Zeta電位為（-31.7±2.1）mV，表明該納米晶體微丸的再分散性良好。

2.3 黃芩苷HPLC分析方法建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Arcus EP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.2％磷酸溶液（59∶41）；檢測波長276 nm；柱溫為室溫；體積流量1.0 min/mL；進樣量10 μL。

2.3.2 專屬性 按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，3種釋放介質中的供試品溶液與黃芩苷對照品在相同保留時間處出現色譜峰。而在相同條件下，僅缺黃芩苷的陰性對照則無色譜峰，表明專屬性良好。色譜圖見圖1。

A.陰性樣品 B.樣品 C.黃芩苷對照品 1.黃芩苷A.negative samP1e B.samP1e C.baica1in reference substance 1.baica1in圖1　黃芩苷在p H 1.2的HC l、p H 6.8的磷酸緩沖液、pH 7.6的磷酸緩沖液中的HPLC色譜圖Flg.1 HPLC chromatograms of balcalln ln HCl（pH 1.2），PBS（pH 6.8）and PBS（pH 7.6）

2.3.3 線性關系考察 精密稱取黃芩苷對照品12.50 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，配制成質量濃度為500 μg/mL的黃芩苷貯備液。分別用PH 1.2的稀鹽酸按不同比例，稀釋成質量濃度為0.5、1、2、4、5、10 μg/mL的系列對照品溶液；PH 6.8的磷酸緩沖液按不同比例，稀釋成質量濃度為1、2、5、10、20、40 μg/mL的系列對照品溶液；PH 7.6的磷酸緩沖液按不同比例，稀釋成質量濃度為5、10、20、40、50、100 μg/mL的系列對照品溶液。分別取續濾液10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，以黃芩苷質量濃度（X）對峰面積（Y）進行線性回歸，得PH 1.2的HC1溶液回歸方程為Y= 34.08X-5.33（r2=0.999 8），PH 6.8的磷酸緩沖液為Y=29.50X+18.40（r2=0.999 6），PH 7.6的磷酸緩沖液為Y=29.32X +36.16（r2= 0.999 7）。結果表明，三者分別在0.5～10、1～40、5～100 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.4 穩定性試驗 分別精密吸取3種釋放介質中的供試液適量，于0、2、4、8 h取樣10 μL，注入高效液相色譜儀，測定黃芩苷的含有量。結果，3種供試液在8 h內，黃芩苷的含有量均沒有顯著變化，其RSD均在0.95％～2.4％之間，表明8 h內三者的穩定性較好。

2.3.5 方法回收率［6］精密稱取黃芩苷對照品3份，分別加入PH 1.2的HC1、PH 6.8及7.6的磷酸緩沖液，分別稀釋成高、中、低3種質量濃度（PH 1.2的HC1 10.00、5.00、2.00 μg/mL；PH 6.8的磷酸緩沖液38.00、19.00、9.50 μg/mL；PH 7.6的磷酸緩沖液96.00、48.00、19.20 μg/mL）的供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，分別記錄峰面積，并代入標準曲線方程計算黃芩苷質量濃度，以測定量與加入量之比計算回收率。結果，黃芩苷在上述3種釋放介質中，高、中、低3種質量濃度的平均回收率均在96.8％～102.3％之間。

2.4 黃芩苷納米晶體微丸的包衣［6，9]取Eudragit S100（約占溶液總體積的20％）適量，加95％乙醇浸泡使其充分溶脹，作為A相；在剩余95％乙醇中加入TEC、滑石粉，勻漿機勻化10 min后，充分攪拌，作為B相。將B相緩緩倒入A相中，室溫攪拌過夜，過200目篩，濾過，即得。稱取載藥微丸適量，置于流化床中，開啟風機，使載藥微丸呈流化狀態，調節按鈕，按“2.1”項下流化床工藝參數進行包衣，然后取出微丸，加入1％滑石粉，60℃熱處理2 h，以使包衣膜融合完整。最終，所得的包衣微丸無花斑、均勻、光滑、不粘連。

2.5 包衣微丸的體外釋放度測定［10-11]鑒于微丸屬于多分散體系，實驗中不易更換釋放介質，故參照《中國藥典》2010年版二部附錄XD中第二法的方法1測定。為模擬微丸在胃腸道中的釋藥情況，依次進行PH 1.2的稀鹽酸（2 h）、PH 6.8的磷酸緩沖液（4 h），PH 7.6的磷酸緩沖液（4 h）的體外釋藥性能考察。精密稱取包衣微丸（約相當于含黃芩苷80 mg）適量，（37±0.5）℃下置于600 mL PH 1.2的稀鹽酸溶液中（2 h），然后加入同溫的0.2 mo1/L磷酸鈉溶液150 mL（用2 mo1/L氫氧化鈉溶液調節PH至6.8，4 h），最后加入同溫的0.2 mo1/L磷酸鈉溶液150 mL（用2 mo1/L氫氧化鈉溶液調節PH至7.6，4 h），轉速100 r/min。各取樣點定時取樣2 mL（同時補加同溫同體積的釋放介質），濾過，取續濾液，按“2.3”項下方法進樣分析，計算黃芩苷累積釋放率。

2.6 包衣處方對黃芩苷納米晶體微丸體外釋藥的影響

2.6.1 增塑劑用量 分別將相當于聚合物量5％、8％、12％的TEC，50％的滑石粉及約占溶液總體積20％的Eudragit S100加入包衣液中，制備包衣微丸，使其增重15％，測定其累積釋放率，各組體外釋藥曲線結果見圖2。由圖可知，隨著增塑劑用量的增加，釋藥時間延遲，當增塑劑用量為5％時，包衣微丸6 h內的累積釋放率達29.25％；當用量8％或12％時，6 h內分別為11.94％和8.90％，而10 h內分別為92.93％和90.29％。但當TEC用量為12％時，槍頭易堵塞，微丸易互相黏結，包衣效率低；當用量為8％時，釋藥過程符合結腸靶向要求，而且包衣效果較好，故選擇增塑劑用量為8％。

圖2　不同用量TEC包衣微丸的釋藥曲線（n=5）Flg.2 Release curves of coated pellets w lth d lfferent amounts of TEC consumptlon（n=5）

2.6.2 抗黏劑用量 分別將相當于聚合物量20％、50％、100％的滑石粉，8％的TEC及約占溶液總體積20％的EudragitS100加入包衣液中，制備包衣微丸，使其增重15％，測定其累積釋放率，各組體外釋藥曲線結果見圖3。由圖可知，不同用量滑石粉所得包衣微丸的釋藥曲線基本一致，但在包衣過程中發現，當滑石粉用量為20％時，微丸易黏連，衣膜表面不均勻，影響藥物釋放；當用量為100％時，槍頭易堵塞；用量為50％時，衣膜表面光滑圓整，釋藥平穩，故最終選擇滑石粉用量為50％。

圖3　不同用量滑石粉包衣微丸的釋藥曲線（n=5）Flg.3 Release curves of coated pellets w lth dlfferent amounts of talcum consum ptlon（n=5）

2.6.3 包衣增重 以約占溶液總體積20％的Eudragit S100為包衣材料，分別加入相當于聚合物量8％的TEC及50％的滑石粉，制備包衣增重分別為10％、15％、20％的包衣微丸，測定累積釋放率，繪制釋藥曲線，結果見圖4。由圖可知，當微丸包衣增重為10％時，藥物在2、6 h內的累積釋放較多，表明連續完整，且具有一定機械強度的衣膜尚未形成。隨著包衣增重的增加，包衣微丸釋藥逐漸減慢，這是因為衣膜厚度增加，其抗張強度增加，介質向衣膜內的滲透速率降低，當包衣增重為15％時，微丸2、6 h內的累積釋放率分別為2.42％、11.94％，而10 h為92.93％，整個釋藥過程符合結腸靶向要求。因此，選擇PH依賴層包衣增重為15％。

圖4　不同包衣增重包衣微丸的釋藥曲線（n=5）Flg.4 Release curves of coated pellets w lth d lfferent welght galns ln coatlng levels（n=5）

2.7 包衣微丸重復性試驗 以最佳包衣處方制備3批PH依賴型黃芩苷納米晶體微丸，按“2.5”項下方法測定其累積釋放率，結果見圖5。由圖可知，3批微丸在模擬人工胃液PH環境下2 h的累計釋放率分別為2.42％、2.43％、2.39％；在模擬人工小腸液PH環境下4 h時，分別為11.94％、12.01％、11.97％；在模擬人工結腸液PH環境下30 min時，分別為48.21％、48.17％、48.25％，而4 h時分別為92.93％、92.87％、92.99％，表明3批微丸靶向釋藥性能良好，工藝穩定。

圖5　3批結腸靶向微丸的釋藥曲線（n=5）Flg.5 Release curves of three batches of colon targetlng coated pellets（n=5）

2.8 包衣微丸體外釋放度比較 按“2.5”項下方法，對最優包衣處方制備的黃芩苷納米晶體微丸和物理混合微丸進行體外釋放度測定，結果見圖6。由圖可知，在PH 1.2的稀鹽酸溶液和PH 6.8的磷酸緩沖液中，兩者累積釋放度均小于13％，并且無顯著性差異；在PH 7.6的磷酸緩沖液中，各取樣點黃芩苷納米晶體包衣微丸的累積釋放率均明顯高于物理混合包衣微丸，10 h內納米晶體包衣微丸的累積釋放率高達93％，具有良好的結腸靶向釋藥特性。

圖6　黃芩苷納米晶體包衣微丸和物理混合包衣微丸的釋藥曲線（n=5）Flg.6 Release curves of pH-dependent colon targetlng pellets of balcalln nanocrystal and physlcalm lxture of balcalln（n=5）

2.9 納米晶體包衣微丸的再分散性測定 精密稱取黃芩苷納米晶體包衣微丸（約相當于含黃芩苷10 mg）適量，置于200 mL PH 7.6的磷酸緩沖液中，充分振搖，直至出現黃色半透明狀，而且無可見大顆粒為止，取適量稀釋至合適濃度，測定粒徑及Zeta電位。結果顯示，包衣微丸再分散后的平均粒徑為（317.93±17.43）nm，多分散指數（PI）為（0.201 1±0.037 1），Zeta電位為（-30.9±1.3）mV，表明該包衣微丸再分散性良好。

3 討論

黃芩苷為難溶性藥物，直接制成微丸藥物溶出困難。本實驗將其制備成納米混懸劑，借用流化床干燥技術，制備載藥微丸，初步解決了納米混懸劑長期放置不穩定的問題。另外，選用流化床進行上樣、包衣，可充分利用其集干燥及包衣于一體、一次成型的優良特性，大大地提高了生產效率。

然后，體外對載藥微丸和包衣微丸再分散特性分別進行了評價，發現再分散后，兩者粒徑稍有增大，但無顯著性差異，表明其再分散性良好。體外釋放度結果表明，納米晶體載藥微丸的釋藥能力顯著優于物理混合載藥微丸，查閱文獻［12］，分析可能的原因有:（1）藥物制備成納米混懸劑后粒徑減小，表面積增大，滲透性增強，藥物的飽和溶解度和溶出率增大；（2）藥物制備成納米混懸劑后，晶型部分或全部發生改變，使無定型態晶型的比例增加，藥物溶解度提高。另外，本實驗未開展SEM和XRD的測定，故釋藥性能的增加基本以前者作解釋，后期將進一步完善其體外表征的研究。

Eudragit S100和FS 30D都是在PH＞7的條件下溶解，是常用的PH依賴型結腸包衣材料。其中，后者成膜后的膜柔韌性較強，包衣時微丸易黏結，但衣膜的完整性較差，藥物易提前泄露，加之易堵塞噴頭，影響包衣效率，故最終選用前者作為包衣材料［11］。單用Eudragit S100時，包衣膜玻璃化轉變溫度（Tg）較高，脆性較大，故包衣時通常加入增塑劑以提高改善衣膜的柔韌性和機械性能［13］，常用的增塑劑有三乙醇甘油酯、鄰苯二甲酸二乙酯、聚乙二醇6000和TEC。文獻［13-14］報道，TEC與Eudragit S100的相容性較好，加入TEC膜的Tg最小，膜的透濕性影響也最低，而且其機械性能和成膜性均較好，故最終選用TEC作為增塑劑。同時，為進一步減少包衣微丸的黏結，通常加入抗黏劑滑石粉。

文獻［15］報道，一個良好的結腸靶向制劑應在服藥后約5 h內釋放，并在10 h內釋放完全，使藥物能分布到升結腸和橫結腸。本實驗制備的微丸在模擬胃腸道PH的介質中5 h后，開始緩慢釋藥，10 h內釋藥量基本達到93％，大致符合結腸靶向制劑特性，可為黃芩苷口服結腸靶向制劑的研究提供參考，但該制劑的體內靶向性和治療結腸炎的機理有待作進一步考察。

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Preparatlon and in vitro release evaluatlon of pH-dependent colon targetlng pellets of balcalln nanocrystal

CHENG Ling1，2， ZHENG Juan1，2， SHEN Gang1，2， QIU Ling1，2， LI Juan-juan1，2， ZHANG Lihong2， WU Na2， HAN Jin2， YUAN Hai-1ong2*
（1.College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China；2.302 Military HosPital of China，Beijing 100039，China）

ABSTRACT:AIM To PrePare PH-dePendent co1on targeting Pe11ets of baica1in nanocrysta1（BC-NC）and inves-book=299,ebook=77tigate the PrescriPtion factor of coated Pe11ets' re1ease behaviors in vitro.METH0DS The high Pressure homogenization combined with u1trasonic techno1ogywere emP1oyed to PrePare baica1in nanosusPensions to be so1idified into targeting Pe11ets by f1uid-bed drying.The redisPersib1e ProPerties of Pe11etswere investigated in terms of Partic1e diameter，Zeta Potentia1，and Po1ydisPersity index（PI）.Then these Pe11ets were coated by G1att f1uid-bed，whose re1ease behaviors in vitro were taken into consideration for the PrescriPtion oPtimization.RESULTS The PrePared Pe11ets demonstrated fine redisPersib1e ProPertieswith the average Partic1e diameter of（281.90±10.56）nm，PI of（0.195 1±0.043 2），Zeta-Potentia1of（-31.7±2.1）mV.The oPtima1 formu1a for the coated Pe11ets was determined to be Eudragit S100 as the coatingmateria1，8％ TEC as the P1asticizer，and 50％ ta1cum Powder as the anti-adherent.Both of the accumu1ated drug re1eases of these Pe11ets in artificia1gastric juice for 2 h and artificia1 intestina1 juice for 4 h were 1ess than 13％，whi1e that in artificia1co1on juice for 4 h wasmore than 90％.C0NCLUSI0N The PH-dePendent co1on targeting Pe11ets of baica1in nanocrysta1exhibit a good co1on-targeted drug re1ease in vitro.

*通信作者:袁海龍，男，博士，博士生導師，研究方向為中藥新型給藥系統。Te1:（010）66933367，E-mai1: yh1Pharm@126.com

作者簡介:程 玲（1989—），女，碩士，研究方向為中藥新制劑、新劑型、新技術。E-mai1: 1073662674@qq.com

基金項目:國家新藥創制重大專項（2012ZX09J12108-04C）；北京市科委重點項目（Z141100002214007）

收稿日期:2015-05-28

中圖分類號:R944

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0298-06