HPLC法同時測定三味龍膽花片中龍膽苦苷及獐牙菜苦苷

余繼英， 吳 亮， 徐傅能， 張靜波， 陳 瑾， 何 林*

（1.四川省醫學科學院，四川省人民醫院藥學部，四川成都610072；2.西南交通大學，四川成都610000；3.四川宇妥藏藥藥業有限公司，四川成都610000）

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HPLC法同時測定三味龍膽花片中龍膽苦苷及獐牙菜苦苷

余繼英1， 吳 亮2， 徐傅能2， 張靜波3， 陳 瑾1， 何 林1*

（1.四川省醫學科學院，四川省人民醫院藥學部，四川成都610072；2.西南交通大學，四川成都610000；3.四川宇妥藏藥藥業有限公司，四川成都610000）

摘要:目的 建立HPLC法同時測定三味龍膽花片（白花龍膽、甘草、蜂蜜）中龍膽苦苷及獐牙菜苦苷的含有量。方法 藥物甲醇提取液的分析采用Diamonsi1C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動相為甲醇-水（25∶75）；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長240 nm。結果 龍膽苦苷和獐牙菜苦苷分別在20.1～201.0 ng（r=0.999 9）和19.76～197.6 ng（r=0.999 9）范圍內有良好的線性關系，平均加樣回收率分別為99.93％ 和100.8％，RSD值分別為1.65％和2.06％。結論 該方法簡便、準確、可靠，可用于三味龍膽花片的質量控制。

關鍵詞:三味龍膽花片；龍膽苦苷；獐牙菜苦苷；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.018

KEY W 0RDS: Sanwei Longdanhua Tab1ets；gentioPicroside；swertiamarin；HPLC

藏藥三味龍膽花片是由白花龍膽（即高山龍膽的干燥花）、甘草及蜂蜜所組成的復方制劑，具有清熱、潤肺功能，主要用于治療肺熱氣喘、咽喉炎，但原標準僅有以龍膽苦苷為對照的薄層鑒別及甘草酸的含有量測定［1］。本實驗根據處方組成并參考相關文獻［2-14］，建立了同時測定三味龍膽花片中龍膽苦苷及獐牙菜苦苷含有量的HPLC方法，以期更加全面地評價其質量，并為進一步研究提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 600高效液相色譜儀，配備Waters 717自動進樣器、SPD-10A檢測器、Waters EmPower色譜工作站（美國Waters公司）；Sartorius-BP211D分析天平（德國賽多利斯公司）。

龍膽苦苷（批號110770-201013，純度96.9％）、獐牙菜苦苷（批號130514，純度98％）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。三味龍膽花片（四川宇妥藏藥藥業有限公司，批號140501、140701、140901）。甲醇為色譜純（美國Dikma公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件和系統適用性實驗 Dikma Diamonsi1C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（25∶75）；檢測波長240 nm；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30℃。理論塔板數按龍膽苦苷及獐牙菜苦苷色譜峰計算，均不低于3 000。龍膽苦苷及獐牙菜苦苷對照品、供試品及陰性樣品溶液的色譜圖見圖1。

A.對照品 B.供試品 C.陰性樣品1.獐牙菜苦苷 2.龍膽苦苷A.reference substances B.samP1es C.negative samP1e 1.swertiamarin 2.gentioPicroside圖1　三味龍膽花片HP L C色譜圖Flg.1 HPLC chromatograms of Sanwel Longdanhua Tablets

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取龍膽苦苷、獐牙菜苦苷對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為1.005 mg/mL和0.987 8 mg/mL的溶液，即得儲備液。再分別精密量取兩種貯備液適量，置于10 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，即得分別含龍膽苦苷和獐牙菜苦苷10.05 μg/mL和9.878 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取三味龍膽花片10片，除去薄膜衣，研細，精密稱取0.5 g，精密加入甲醇20 mL，稱定質量，加熱回流15 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，取5 mL置于離心管，4 000 r/min離心5 min，精密量取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液 按三味龍膽花片的處方和制法制備陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線及線性范圍 精密吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10、12、15、18、20 μL，注入色譜儀，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到回歸方程，見表1。

表1　兩種成分回歸方程Tab.1 Regresslon equatlons of two constltuents

2.3.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次，以峰面積為指標進行考察。結果，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的RSD分別為0.2％、0.3％（n =6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一樣品，按“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，進樣測定。結果，RSD分別為1.86％、1.17％（n =6），表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一對照品溶液適量，分別在0、2、4、6、8、12 h進樣測定。結果，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷峰面積的RSD分別為1.45％和1.11％，表明溶液在12 h內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率 精密稱取含有量已知的3味龍膽花片樣品粉末0.25 g，共9份，分別加入龍膽苦苷和獐牙菜苦苷儲備液適量，使其最終含有量約為樣品的80％、100％和120％，每個水平各3份，按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，進樣測定，結果見表2。

表2　加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests（n=9）

2.4 樣品測定 取3個批號的樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每批平行3份，在“2.1”項色譜條件下進樣10 μL，記錄峰面積，外標法計算兩組分含有量，結果見表3。

表3　樣品測定結果（±s，n=3）Tab.3 Determ lnatlon results of samp les（±s，n=3）

表3　樣品測定結果（±s，n=3）Tab.3 Determ lnatlon results of samp les（±s，n=3）

樣品批號　龍膽苦苷/（mg·g-1）　獐牙菜苦苷/（mg·g-1）140501　3.615±0.093　4.144±0.110 140701　2.876±0.067　3.768±0.051 140901　3.215±0.048　4.553±0.088

3 討論

根據制劑處方特點和指標成分理化性質，以不同比例甲醇（25％、50％、100％）為溶劑，考察了不同提取方法（超聲、加熱回流）和不同提取時間（15 min、30 min、1 h）的提取效率，同時以濾過和離心兩種方式處理供試液。結果，超聲提取效率較低，而加熱回流不同時間下的提取效率無顯著差異，另外提取物直接離心處理時的重復性更好，操作也更方便。

參照文獻，考察了甲醇-水和乙腈-水系統的分離效果，綜合考慮出峰時間、峰形等因素，最終選用流動相為甲醇-水（25∶75）。

3批樣品指標成分的含有量有一定差異，這可能由于原料產地、采收時間等因素的不同［15］。而且，對指標成分進行控制，有助于產品質量的全面評價，并為進一步的體內研究打下基礎。

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Slmultaneous determ lnatlon of gentloplcroslde and swertlamarln ln Sanwel Longdanhua Tablets by HPLC

YU Ji-ying1， WU Liang2， XU Fu-neng2， ZHANG Jing-bo3， CHEN Jin1， HE Lin1*
（1.Sichuan Provincial Academy of Medical Sciences，DePartment of Pharmacy，Sichuan Provincial PeoPle' s HosPital，Chengdu 610072，China；2.Southwest Jiaotong University，Chengdu 610000，China；3.Sichuan Yutuo Tibetan Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chengdu 610000，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLCmethod for the simu1taneous determination of gentioPicroside and swertiamarin in Sanwei Longdanhua Tab1ets（Gentian algida，Glycyrrhiza uralensis and honey）by HPLC.METH 0 DS The ana1ysis of methano1ic extract of this drug was Performed on Diamonsi1C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm），with co1umn temPeraturemaintained at30℃，metho1-H2O（25∶75）asmobi1e Phase at a f1ow rate ofbook=319,ebook=971 mL/min and detection wave1ength set at 240 nm.RESULTS The 1inear ranges were 20.1 -201.0 ng （r=0.999 9）for gentioPicroside and 19.76 -197.6 ng（r=0.999 9）for swertiamarin，whose average recoveries were 99.93％ and 100.8％ with the RSDs of 1.65％ and 2.06％，resPective1y.C0NCLUSI0 N This simP1e and accuratemethod is re1iab1e for the qua1ity contro1of Sanwei Longdanhua Tab1ets.

*通信作者:何 林，男，博士，研究員，碩士生導師，從事新制劑及其藥動學研究。Te1:（028）87393932，E-mai1: he1inn@tom.com

作者簡介:余繼英（1963—），女，碩士，主任藥師，從事藥物制劑質量研究。Te1:（028）87393316，E-mai1: yujiying@163.com

基金項目:四川省科技支撐計劃（2012SZ0182）

收稿日期:2015-05-13

中圖分類號:R927.2

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0318-04