補腦軟膠囊質量標準的研究

李喜香， 劉效栓， 畢映燕， 包 強， 李季文， 李妍怡， 潘從澤， 張亞會， 錢夢茹

（甘肅省中醫院，甘肅蘭州730050）

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補腦軟膠囊質量標準的研究

李喜香， 劉效栓， 畢映燕， 包 強， 李季文， 李妍怡， 潘從澤， 張亞會， 錢夢茹

（甘肅省中醫院，甘肅蘭州730050）

摘要:目的 建立補腦軟膠囊（當歸、川芎、黃芪、赤芍等）的質量標準。方法 TLC法鑒別膠囊中的當歸、川芎和補骨脂，HPLC法對芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含有量進行測定。分析采用Waters C18色譜柱；流動相為乙腈-0.1％磷酸（16∶84）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫室溫。結果 當歸、川芎和補骨脂可以被準確地鑒別。芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷分別在157.5～787.5 μg/mL（r=0.999 6）、10.9～54.5 μg/mL （r=0.999 6）、8.9～44.5 μg/mL（r=0.999 5）范圍內線性關系良好，平均回收率分別98.87％、98.56、98.91％ （RSD分別為1.7％、2.4％、2.5％，n =5）。結論 該方法操作簡便，專屬性強，重復性好，能有效控制補腦軟膠囊的質量.

關鍵詞:補腦軟膠囊；芍藥苷；阿魏酸；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；TLC；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.019

Quallty standard for Bunao Soft Capsules

LIXi-xiang， LIU Xiao-shuan， BIYing-yan， BAO Qiang， LIJi-wen， LIYan-yi， PAN Cong-ze，ZHANG Ya-hui， QIAN Meng-ru
（Gansu Provincial HosPital of TCM，Lanzhou 730050，China）

ABSTRACT: AIM To set uP a qua1ity standard for Bunao Soft CaPsu1es（Angelicae sinensis Radix，Liguszici Chuanxiong Radix，AstragaliMembranacei Radix，Paeoniae Rubrae Radix，etc.）.METH0DS TLC was aPP1ied to detecting the existence of Angelica sinensis，Ligusticum chuanxiong and Psoralea corylifolia in the caPsu1es，whi1e HPLC was used for the quantity determination of Paeonif1orin，feru1ic acid and ca1ycosin-7-O-β-D-g1ycoside.The ana1ysiswas conducted on Waters C18co1umn（4.6 mm×250 mm，5 μm）at room temPerature，with acetonitri1e-0.1％ PhosPhoric acid（16∶84）as themobi1e Phase at a f1ow rate of 1.0 mL/min and 230 nm for the detection wave1ength.RESULTS Angelica sinensis，Ligusticum chuanxiong and Psoralea corylifolia cou1d be sPecifica11y identified.Paeonif1orin，feru1ic acid and ca1ycosin-7-O-β-D-g1ycoside had good 1inear re1ationshiPs within the ranges of 157.5-787.5 μg/mL（r=0.999 6），10.9-54.5 μg/mL（r=0.999 6）and 8.9-44.5 μg/mL（r= 0.999 5），whose average recoveries were 98.87％，98.56％ and 98.91％ with the RSDs of 1.7％，2.4％ and 2.5％（n =5），resPective1y.C0NCLUSI0N Besides the strong sPecificity and good reProducibi1ity，thismethod is easy to oPerate in terms of effective qua1ity survei11ance of Bunao Soft CaPsu1es.

KEYW 0RDS: Bunao Soft CaPsu1es；Paeonif1orin；feru1ic acid；ca1ycosin-7-O-β-D-g1ycoside；thin-1ayer chromatograPhy（TLC）；high Performance 1iquid chromatograPhy（HPLC）

補腦膏是我院自制制劑（注冊號甘藥制字Z04000828），由夏勇潮醫師在古方“佛手方（當歸、川芎）”的基礎上，合用黃芪、赤芍、補骨脂、枸杞、淫羊藿、龜板、水蛭、仙靈脾、益母草、仙茅、黃精、甘草制成（專利號ZL961222654，國際專利主分類號A61K35/78），具有益氣養血、填精補髓、化瘀通絡功效，用于腦外傷性神經損傷及后遺癥，腦炎、腦膜炎后遺癥，動脈硬化性腦損害，腦、脊髓變性性疾病，弱智兒童及腦性癱瘓等癥的治療［1］，臨床應用幾十年，效果良好。在前期研究過程中，已將其劑型改進成軟膠囊，為了更好地控制其質量，本實驗采用薄層色譜（TLC）法，對川芎、當歸、補骨脂藥材進行定性鑒別，再采用高效液相色譜（HPLC）法，對方中赤芍主要成分芍藥苷［2-5］、黃芪主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷［6-8］、當歸與川芎主要成分阿魏酸［9-14］同時進行測定，為該制劑的進一步開發研究提供技術支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括Waters 1525泵、Waters 717進樣器、Waters 2487雙通道紫外檢測器；HS6150超聲波清洗儀（天津恒奧科技發展有限公司）；Mett1er AE240電子天平（萬分之一，德國賽多利斯公司）；D6B/20-002A電熱干燥箱；薄層板（自制）。

1.2 試藥 當歸、川芎、黃芪、赤芍等14味藥材購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經甘肅省藥品檢驗研究院宋平順主任藥師鑒定為正品。芍藥苷（批號110736-200629）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201304）、阿魏酸（批號110773-200611）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。乙腈、甲醇為色譜純（天津光復精細化工研究所）；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 當歸、川芎的鑒別［15]取軟膠囊內容物20粒，剪碎，精密稱取4.0 g，加1％碳酸氫鈉50 mL，超聲20 min，取上清液，用鹽酸調節PH至2～3，乙醚萃取2次，每次20 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取阿魏酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg原料的溶液，作為對照品溶液。取缺當歸、川芎藥材的陰性制劑，同法制成陰性對照溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于以CMC-Na為黏合劑的同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-冰乙酸（5∶3∶0.1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖1。由圖可知，供試品色譜在與對照藥材同一位置處顯相同熒光斑點，而陰性樣品不顯示。

2.2 補腦軟膠囊中補骨脂的鑒別［15]取軟膠囊內容物20粒，剪碎，精密稱取4.0 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作為供試品溶液。取補骨脂0.36 g，同法制成對照藥材溶液。再根據處方，制備缺補骨脂的陰性樣品溶液。按照薄層色譜法（附錄ⅥB），吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于以CMC-Na為黏合劑的同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（5∶1）為展開劑展開，取出，晾干，噴以10％氫氧化鉀-甲醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖1。由圖可知，供試品色譜在與對照藥材相應的位置上顯相同顏色的斑點，而陰性樣品不顯示。

A.3-阿魏酸 1、2、4-補腦軟膠囊 5-陰性制劑 B.3-補骨脂 1、2、4-補腦軟膠囊 5-陰性制劑A.3-feru1ic acid 1，2 and 4-Bunao Soft CaPsu1es 5-negative samP1e B.3-Psoralea corylifolia 1，2 and 4-Bunao Soft CaPsu1es 5-negative samP1e圖1　當歸、川芎、補骨脂T L C色譜圖Flg.1 TLC chromatograms of Angelica sinensis，Ligusticum chuanxiong and Psoralea corylifolia

2.3 含有量測定

2.3.1 色譜條件與系統適應性試驗 Waters Symmetry Shie1d-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為乙腈（A）-0.1％磷酸（B）（16∶84）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫室溫；進樣量10 μL。在該色譜條件下，供試品中其他成分與芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸均分離良好，陰性樣品在對照品出峰處無干擾，表明專屬性良好。結果見圖2。

A.對照品 B.樣品 C.陰性制劑A.reference substances B.samP1es C.negative samP1e1.芍藥苷 2.毛蕊異黃酮葡萄糖苷 3.阿魏酸1.Paeonif1orin 2.ca1ycosin-7-O-β-D-g1ycoside 3.feru1ic acid圖2　高效液相色譜圖Flg.2 HPLC chromatogram s

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸對照品適量，加甲醇溶解，稀釋至刻度，制成每1 mL含芍藥苷1.575 mg，毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.09 mg，阿魏酸0.89 mg的儲備液，即得。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取補腦軟膠囊內容物4.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加石油醚30 mL，超聲（300 W、25 kHz）處理10 min，棄去石油醚液，殘渣加甲醇30 mL，20℃超聲（300 W、25 kHz）處理2次，每次30 min，過濾。合并濾液，減壓回收甲醇，殘渣用甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.2.3 陰性樣品制備 按補腦軟膠囊的處方比例，稱取除當歸、川芎、黃芪、赤芍外的其余藥味，根據制備工藝制得陰性樣品，按“2.3.2.2”項下方法制得陰性對照液。

2.3.3 線性關系考察 取“2.3.2.1”項下對照品儲備液適量，甲醇稀釋后制得每1 mL含芍藥苷157.5、315.0、472.5、630.0、787.5 μg，含毛蕊異黃酮葡萄糖苷10.9、21.8、32.7、43.6、54.5 μg，含阿魏酸8.9、17.8、26.7、35.6、44.5 μg的標樣溶液，進樣10 μL，每個質量濃度進樣3次，在“2.3.1”項色譜條件下測定，以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，回歸方程分別為Y=9.00×105X-5.01×105，r=0.999 6；Y=2.00×107X-1.46×107，r=0.999 6；Y=2.00×107X+2.04×107，r=0.999 5，表明芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，進樣6次，測定峰面積。結果，芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸的RSD分別為0.9％、1.1％、0.8％，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗 精密吸取同一批號（140306）供試品溶液，分別在0、4、8、12、18、24 h進樣10 μL，測定峰面積。結果，芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸的RSD分別為1.3％、0.9％、1.4％，表明樣品在24 h內穩定性良好。

2.3.6 重復性試驗 取同一批次（140306）樣品，按“2.3.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，精密吸取10 μL，測定峰面積。結果，芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸的RSD分別為1.6％、1.2％、1.7％，表明該方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的補腦軟膠囊內容物2.0 g（芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸的含有量分別為1.75、0.048、0.079 mg/g），分別加入1.75、1.09、0.89 mg/mL的芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸對照品溶液1.8、0.080、0.2 mL，按“2.3.2”項下方法制備溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進行測定，計算回收率。結果見表1。

表1　加樣回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests

2.3.8 樣品測定 精密稱取補腦軟膠囊內容物（140306、140520、140617）4.0 g，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，以“2.3.3”項下標準曲線計算各成分含有量。結果見表2。

表2　樣品測定結果Tab.2 Determ lnatlon results of sam p les

3 討論

在190～800 nm范圍內，分別對芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸進行全波長掃描，發現其最大吸收波長分別為230、260、316 nm。其中在260 nm處，芍藥苷、阿魏酸的吸收度均小于230 nm；在316 nm處，芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的吸收度均小于230、260 nm；在230 nm處，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的吸收度與260 nm處基本一致，故在230 nm下對軟膠囊中3種有效成分的含有量進行測定。另外，選取甲醇-酸、乙腈-酸流動相系統進行比較，發現阿魏酸為酸性物質，在乙腈-0.1％磷酸等度洗脫系統條件下，3個有效成分與相鄰色譜峰均能完全分離，故選擇乙腈-磷酸系統作為流動相［4］。

軟膠囊內容物中含有蜂蠟、司盤-80、大豆油等脂溶性物質，如直接用甲醇超聲處理提取后進樣，樣品在放置過程時，容器壁有脂溶性物質的析出，影響其測定。因此，先用石油醚將此類成分去除，再用甲醇超聲提取。由于2種方法所測得3種有效成分的峰面積無差異，故選擇先用石油醚處理，再用甲醇處理的樣品制備方式。同時，對超聲次數進行考察，發現超聲提取2次與3次相比較，峰面積差異小于5％，故選擇超聲2次作為樣品處理方式。

在當歸、川芎薄層色譜鑒別方法中，本實驗嘗試環己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.5）、甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸（4∶1∶0.1）等展開系統，但均未將阿魏酸與相鄰斑點分離，而在苯-乙酸乙酯-冰乙酸（5∶3∶0.1）展開系統下，阿魏酸薄層斑點清晰，而且專屬性強。

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作者簡介:李喜香（1968—），女，主任中藥師，從事中藥制劑研發工作。Te1: 15002550389，E-mai1: Lixixiang929@163.com

基金項目:蘭州市科技計劃項目（2012-2-78）

收稿日期:2015-06-12

中圖分類號:R927.2

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0321-05