補腎活血方與其組方藥材指紋圖譜的相關性

王紫燕， 張 梅*， 李春沁， 劉美琳， 董佳悅， 穆敏婕， 謝學軍

（1.成都中醫藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137；2.成都中醫藥大學臨床醫學院，四川成都610075）

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補腎活血方與其組方藥材指紋圖譜的相關性

王紫燕1， 張 梅1*， 李春沁1， 劉美琳1， 董佳悅1， 穆敏婕1， 謝學軍2*

（1.成都中醫藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137；2.成都中醫藥大學臨床醫學院，四川成都610075）

摘要:目的 建立補腎活血方（地黃、丹參、葛根、人參）的HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜，研究該方與其組方藥材指紋圖譜的相關性。方法 通過HPLC-DAD-ELSD法建立復方及各單味藥材指紋圖譜，以色譜峰保留時間和紫外光譜信息為考察指標。結果 補腎活血方HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜中標定了35個共有峰，其中有10個色譜峰來自丹參，9個來自葛根，9個來自人參，地黃對共有峰的貢獻不明顯。另外，1個色譜峰為丹參和葛根共有，6個色譜峰不能明確其來源。結論 HPLC-DAD建立的指紋圖譜反映丹參和葛根中化學成分的相似度較高（均大于0.8），而HPLCELSD建立的指紋圖譜反映人參中化學成分的相似度相對偏低。

關鍵詞:補腎活血方；組方藥材；指紋圖譜；HPLC-DAD-ELSD

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.024

KEY W 0RDS: Bushen Huoxue PrescriPtion；re1evant herbs；fingerPrints；HPLC-DAD-ELSD

糖尿病是世界各國日益關注的公共健康問題，其中糖尿病視網膜病變（diabetic retinoPathy，DR）是導致糖尿病患者失明的最主要、最嚴重、最棘手的并發癥，也是世界四大致盲眼病之一。中醫藥在改善糖尿病患者的視力損害，延緩DR的發生發展，促使發生病理變化的眼底恢復以及改善提高患者全身整體狀況和生活質量方面有其獨特的優勢，顯示出廣闊的前景。補腎活血方由成都中醫藥大學附屬醫院眼科謝學軍教授等研制而成，由地黃、丹參、葛根、人參等中藥配伍組成，用于防治糖尿病性視網膜病變，效果良好［1］。謝學軍課題組對其防治DR的作用機制進行了深入研究，已取得多項研究結果［2-7］，但對該方藥效物質基礎及質量控制的研究還鮮有報道。

中藥指紋圖譜已成為國際公認的控制中藥或天然藥物質量的一種有效手段，它能夠較全面地反映出中藥質量的綜合信息［8］。中藥復方由組方中藥配伍而成，文獻［9-13］報道，在分別建立復方與單味藥材指紋圖譜的基礎上，通過研究其色譜峰之間的相關性，歸屬復方色譜峰的來源，分析復方與單味藥材化學成分的關聯性，可為復方藥效物質基礎研究及質量控制奠定基礎。本實驗采用HPLCDAD-ELSD法建立補腎活血方指紋圖譜，并對復方化學成分指紋圖譜色譜峰的歸屬進行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agi1ent 1200高效液相色譜儀，包括Agi1ent 1200四元泵、Agi1ent 1200色譜工作站、DAD檢測器（美國Agi1ent公司）；A11tech 3300型蒸發光散射檢測器（美國A11tech公司）；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版，國家藥典委員會）；KQ-3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16G型高速臺式離心機（上海右一儀器有限公司）。

1.2 試藥 乙腈為色譜純（美國Tedia公司）；其他試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）；純凈水（Mi11i-Q純水制備系統制備，0.45 μm濾膜濾過）。

地黃、丹參、葛根、人參購自成都市荷花池藥材市場，經成都中醫藥大學中藥資源與鑒定系裴瑾教授鑒定，分別為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥塊根、唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根、豆科植物甘葛藤粉葛Pueraria thomsoni i Benth.的干燥根、五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥細支根或須根。

丹酚酸B（sa1viano1ic acid B）、葛根素（Puerarin）、人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）、人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1）對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98％。

2方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 按照課題組提供的方法制備樣品［1］。取復方粉末0.2 g，加甲醇5 mL超聲溶解，離心（3 000 r/min）10 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜備用。單味藥、復方陰性的處理方法同復方，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜備用。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取上述對照品適量，甲醇超聲溶解，合并至同一量瓶中，甲醇定容，即得。

2.3 色譜條件 Inertsi1 ODS-SP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05％甲酸水（B）；體積流量1 mL/min；柱溫30℃；進樣量20 μL；檢測波長250 nm；漂移管溫度50℃；載氣流量2.5 L/min；增益值1；線性梯度洗脫（0～10 min，1％～10％A；10～15 min，10％～16％A；15～27 min，16％～23％A；27～50 min，23％～39％A；50～60 min，39％～50％ A；60～65 min，50％～70％ A；65～70 min，70％～100％A）。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1），在“2.3”項色譜條件下連續進樣6次，進行HPLC分析。結果，在各共有峰的相對保留時間RSD中，DAD檢測器小于1％，ELSD檢測器小于3％；在各共有峰的相對峰面積RSD中，DAD檢測器小于1％，ELSD檢測器小于3％，說明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1），在“2.3”項色譜條件下，于0、3、6、12、18、24 h進行HPLC分析。結果，在各共有峰的相對保留時間RSD中，DAD檢測器小于2％，ELSD檢測器小于5％；在各共有峰的相對峰面積RSD中，DAD檢測器小于1％，ELSD檢測器小于3％，說明溶液在24 h內穩定。

2.4.3 重復性試驗 取同一樣品（S1）6份，按“2.1”項下方法制備樣品，在“2.3”項色譜條件下進行HPLC分析。結果，在各共有峰的相對保留時間RSD中，DAD檢測器小于2％，ELSD檢測器小于5％；在各共有峰的相對峰面積RSD中，DAD檢測器小于3％，ELSD檢測器小于5％，說明該方法重復性良好。

2.5 HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜的建立及特征峰的標定 取10批樣品（來源見表1），按“2.1”和“2.3”項下方法操作，根據供試品溶液HPLC譜的相關系數來比較供試品譜圖。結果，DAD檢測器中有23個峰是各批供試品所共有的，ELSD檢測器中有12個峰是各供試品所共有的，因此確定這35個峰為共有指紋峰，色譜圖見圖1～2。其中，8號峰為葛根素（參照峰），20號峰為丹酚酸B，5'號峰為人參皂苷Rg1，9'號峰為人參皂苷Rb1（參照峰）。

表1　1 0批樣品的來源Tab.1 Sources of ten batches of samples

圖1　補腎活血方HP LC-DAD對照指紋圖譜Flg.1 HPLC-DAD reference flngerprlnt of Bushen Huoxue prescrlptlon

圖2　補腎活血方HPLC-ELSD對照指紋圖譜Flg.2 HPLC-ELSD reference flngerprlnt of Bushen Huoxue prescrlptlon

2.6 指紋圖譜相似度分析 應用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”軟件，以10批樣品的指紋生成對照指紋圖譜R，并評價其相似度。指紋圖譜見圖3～4。相似度結果見表2～3。

圖3　補腎活血方HPLC-DAD指紋圖譜Flg.3 HPLC-DAD flngerp rlnts of Bushen Huoxue prescrlptlon

圖4　補腎活血方HPLC-ELSD指紋圖譜Flg.4 HPLC-ELSD flngerprlnts of Bushen Huoxue prescrlptlon

表2　DAD檢測器中1 0批樣品相似度Tab.2 Slm llarltles of ten batches of sam p les ln DAD detector

表3　E LSD檢測器中1 0批樣品相似度Tab.3 Slm llarltles of ten batches of samples ln ELSD detector

2.7 復方與藥材指紋圖譜相關性分析 采用HPLC-DAD-ELSD法，在“2.3”項色譜條件下操作，得到復方、藥材、復方陰性供試品的指紋圖譜，以色譜峰保留時間和紫外光譜特征為指標，考察相關性，對復方化學指紋圖譜的峰歸屬進行分析。結果，有10個色譜峰來自丹參（圖5），9個來自葛根（圖6），9個來自人參（圖7），地黃對復方共有峰的貢獻不明顯。另外，1個色譜峰為丹參和葛根共有，6個色譜峰不能明確其來源。

圖5　復方與丹參藥材HPLC-DAD圖譜Flg.5 HPLC-DAD chromatogram s of p rescrlptlon and Salvia m iltiorrhiza Bge.

圖6　復方與葛根藥材HPLC-DAD圖譜Flg.6 HPLC-DAD chromatogram s of prescrlptlon and Pueraria thomsoni l Benth.

圖7　復方與人參藥材HPLC-ELSD圖譜Flg.7 HPLC-ELSD chromatograms of prescrlptlon and Panax ginseng C.A.M ey.

3 討論

3.1 指紋圖譜相似度評價 實驗中10批補腎活血方由不同來源的單味藥材隨機組合而成。HPLCDAD建立的指紋圖譜主要反映復方中丹參和葛根藥材所含的化學成分，其相似度較高（均大于0.8），說明不同產地兩者化學成分的差異較小；HPLC-ELSD建立的指紋圖譜主要反映復方中人參的化學成分，其相似度相對偏低，說明不同產地和貯存時間下，人參的成分有一定差異。

3.2 檢測方式的選擇 將DAD與ELSD檢測器聯用，同時檢測到有紫外吸收、紫外末端吸收以及無紫外吸收的成分，得到一次進樣后同時測定不同成分的指紋圖譜，省時方便。

3.3 洗脫條件的考察 補腎活血方成分復雜，本實驗考察了乙腈-0.05％甲酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.5％冰乙酸水、甲醇-0.05％甲酸水等流動相的等度及梯度洗脫條件。結果發現，以乙腈-0.05％甲酸水梯度洗脫時，各色譜峰基本分離。3.4 檢測波長的考察 對DAD檢測器所得的指紋圖譜進行了190～400 nm的全波長掃描，重點考察了250、254、270、286 nm幾個波長下的峰數目和峰形。結果表明，在250 nm波長下，指紋圖譜色譜峰的數目最多，峰形較優。

3.5 ELSD檢測器參數的考察 分別對漂移管溫度（45、50℃）及載氣流量（1.5、2.0、2.5 L/min）等參數進行了考察。結果表明，漂移管溫度為50℃，載氣流量為2.5 L/min時，色譜圖基線信噪比最優，色譜峰分離良好。

3.6 復方與組方藥材相關性分析 比較復方與組方藥材的色譜圖發現，組方藥材對共有峰的貢獻為丹參（5、10、15～21、23）、葛根（6～9、11～14、22）、人參（3'～5'、7'～12'），而且1號峰為丹參和葛根共有。丹參和葛根的大部分色譜峰都能與復方對應，有良好的相關性，但人參60 min后的色譜峰在復方中沒有體現，可能是由于復方在煎煮過程中，成分之間相互發生作用，某些成分轉化或損失而導致。2～4、1'、2'、6'號峰來源不清，是否是組方藥材共煎時產生的新成分暫不能確定。綜上所述，復方與組方藥材的成分存在差異，兩者之間并非簡單的加和關系。

同時，采用DAD檢測器在203 nm波長下，對復方與地黃的相關性進行研究，但地黃對復方共有峰的貢獻不明顯。究其原因，復方中環烯醚萜類、酚酸類及異黃酮類成分的極性均較大，酚酸類及異黃酮類成分的峰面積遠大于環烯醚萜類，而且末端檢測基線不平穩，環烯醚萜類成分受到較強干擾。因此，在兼顧復方各類成分分析時，沒能體現該類成分對復方的貢獻，有待于作進一步探索。

本實驗對復方成分的來源歸屬作了初步研究，為闡明補腎活血方的藥效物質基礎提供了實驗依據。對于復方各成分的結構確定，還需結合HPLCDAD-MS、UPLC-Q-TOF/MS及UPLC-Q-TOF-MS/ MS等手段進行深入研究。

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Relatlonshlp between the flngerprlnts of Bushen Huoxue prescrlptlon and lts relevant herbs

WANG Zi-yan1， ZHANG Mei1*， LIChun-qin1， LIU Mei-1in1， DONG Jia-yue1， MU Min-jie1，XIE Xue-jun2*
（1.School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine；Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicinesof Ministry of Education；State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，DeveloPment and Utilization of Chinese Medicine Resources，Chengdu 611137，China；2.School of Clinical Medicine，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine，Chengdu 610075，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLC-DAD-ELSD fingerPrint of Bushen Huoxue PrescriPtion（Rehmannia glutinosa Libosch.，Salvia miltiorrhiza Bge.，Pueraria thomsoni i Benth.and Panax ginseng C.A.Mey.）and study the re1ationshiP between the fingerPrints of this PrescriPtion and its re1evantherbs.METH0DS The finger-Prints of Bushen Huoxue PrescriPtion and its re1evant herbs were estab1ished by HPLC-DAD-ELSD.The retention time and UV sPectra1information of chromatograPhic Peakswere taken as indices.RESULTS Thirty-five common Peakswere demarcated in the HPLC-DAD-ELSD fingerPrint of Bushen Huoxue PrescriPtion.Among them，tenbook=342,ebook=120Peaks came from S.miltiorrhiza，nine Peaks came from P.thomsonii，nine Peaks came from P.ginseng，and R. glutinosa did notmake a great contribution to the common Peaks.In addition，one Peak came from S.miltiorrhiza and P.Ginseng，whi1e another six Peaks cou1d not be identified.C0NCLUSI0N HPLC-DAD fingerPrint ref1ects the high simi1arities（＞0.8）of chemica1 constituents in S.Miltiorrhiza and P.Thomsonii，whi1e HPLCELSD fingerPrint revea1s the 1ow simi1arities of those in P.Ginseng.

*通信作者:張 梅（1963—），女，教授，博士生導師，從事中藥及其復方物質基礎的質量標準化研究。Te1:（028）61800231，E-mai1: zhangmei63@126.com謝學軍（1963—），女，教授，博士生導師，從事中西醫結合防治眼底病的基礎與臨床研究。Te1:（028）87767332，E-mai1: xxj8848@163.com

作者簡介:王紫燕（1991—），女（回族），碩士，研究方向為藥物分析。Te1: 18384257028，E-mai1: 462207970@qq.com

基金項目:國家自然科學基金項目（81473735）

收稿日期:2015-05-12

中圖分類號:R284.1

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0341-05