砂仁揮發油GC-MS指紋圖譜與其鎮痛作用的關系

李生茂， 葉 強， 敖 慧*

（1.川北醫學院藥學院，四川南充637000；2.成都中醫藥大學，四川成都611137）

?

砂仁揮發油GC-MS指紋圖譜與其鎮痛作用的關系

李生茂1， 葉 強2， 敖 慧2*

（1.川北醫學院藥學院，四川南充637000；2.成都中醫藥大學，四川成都611137）

摘要:目的 研究砂仁Amomi Fructus揮發油GC-MS指紋圖譜與其鎮痛作用的關系。方法 GC-MS法建立18批不同產地砂仁揮發油的指紋圖譜，醋酸致小鼠扭體實驗研究其鎮痛作用，灰色關聯度法研究譜效關系。結果 GC-MS指紋圖譜中有7個共有峰，與揮發油的鎮痛作用有一定關聯（0.858～0.718），大小依次為樟腦＞乙酸龍腦酯＞龍腦＞匙葉桉油烯＞D-檸檬烯＞莰烯＞月桂烯。結論 砂仁揮發油的鎮痛作用為多組分聯合效應的結果。

關鍵詞:砂仁；揮發油；GC-MS指紋圖譜；鎮痛作用；灰色關聯度

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.025

KEY W 0RDS: Amomi Fructus；essentia1oi1；GC-MS fingerPrints；ana1gesia effect；grey corre1ation

砂仁為姜科植物陽春砂Amomum villosum Lour.、綠殼砂Amomum villosum Lour.Var.xanthioides T.L.Wu et Senjen或海南砂Amomum longiligulare T.L.Wu的干燥成熟果實［1］，其主要藥效部位是揮發油，具有抗潰瘍、抗炎、鎮痛、止瀉、抗菌等廣泛的藥理作用［2］。其中，乙酸龍腦酯、樟腦、莰烯、檸檬烯和龍腦等為砂仁揮發油的主要組成部分［3-4］，并以乙酸龍腦酯的含有量最高，抗炎鎮痛等活性較顯著［5-6］，為砂仁藥材的質控成分［1］，而其它幾種主要成分是否也起到相關作用目前尚不清楚。同時，目前對砂仁揮發油的研究大多為化學成分指紋圖譜分析或藥效學實驗，而對其藥效作用與化學物質基礎的整體性、聯系性探索較少。本課題組前期對不同品種砂仁的抗炎活性進行比較，并研究其物質基礎，發現該活性與龍腦、芳樟醇、乙酸龍腦酯等多種成分關系密切。本實驗進一步對砂仁揮發油GC-MS指紋圖譜及其鎮痛作用進行了研究，并采用灰色關聯度分析法考察其化學信息譜與鎮痛作用的關系，以期初步揭示砂仁揮發油的鎮痛物質基礎，并為進一步控制該藥材的質量提供一定依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agi1ent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，包括Agi1ent GC-MSD工作站（美國安捷倫公司）；Sartorius BP211D AG電子天平（德國賽多利斯公司）；輕油提取器（四川蜀牛玻璃儀器有限公司）。

1.2 試藥 18批砂仁藥材經成都中醫藥大學中藥資源與鑒定系陳璐講師鑒定，確認為陽春砂Amomum villosum Lour.或綠殼砂Amomum villosum Lour.var.xauthioides T.L.Wu et Senjen的干燥成熟果實，具體見表1。羧甲基纖維素鈉（西安惠安纖維素化工有限公司，批號20130416）；正己烷（國藥集團化學試劑有限公司，批號T20100928）；無水硫酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號20140114）；冰醋酸（成都市科龍化工試劑廠，批號20100826）均為分析純；水為蒸餾水。

表1　砂仁來源Tab.1 Sources of Amom i Fructus

1.3 動物 SPF級昆明種小鼠200只，雌雄各半，許可證號SCXK（川）2008-11，體質量18～22 g，由成都中醫藥大學動物中心提供。

2 方法與結果

2.1 砂仁揮發油鎮痛作用研究

2.1.1 樣品制備 將各批次砂仁藥材粉碎，過20目篩，稱取10 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入30倍量（300 mL）水，按《中國藥典》2010年版一部揮發油測定法（附錄XD甲法）提取揮發油，水蒸汽蒸餾5 h，收集揮發油（均呈淡黃色、油狀），0.5％羧甲基纖維素鈉混懸，配制成相當于生藥125 g/L的藥液，備用。

2.1.2 實驗方法 參考文獻［7］，取小鼠200只，隨機分為20組，每組10只，分別為模型組、陽性藥組和18個給藥組。陽性藥組（62.5 mg/L鹽酸嗎啡水溶液）及各給藥組按0.4 mL/10 g劑量灌胃給予相應藥液，模型組灌胃給予相應體積的生理鹽水，每天1次，連續3 d。最后一次給藥0.5 h后，腹腔注射0.6％冰醋酸（0.2 mL/10 g，臨用前配制），記錄各組小鼠給藥后20 min內扭體（腹部收縮內凹、仲展后肢、臀部抬高、蠕行）的次數，計算鎮痛率，公式為鎮痛率=（模型組扭體次數-給藥組扭體次數）/模型組扭體次數×100％

2.1.4 實驗結果 與模型組比較，18批砂仁揮發油均有不同程度的鎮痛作用，其中S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S16和S17比較明顯（P＜0.01或0.05），見表2。

2.2 砂仁揮發油GC-MS指紋圖譜

2.2.1 樣品制備 按“2.1.1”項下方法制備砂仁揮發油，加正己烷1 mL稀釋，無水硫酸鈉除去水分，微孔濾膜過濾，GC-MS分析。

2.2.2 氣相色譜-質譜聯用分析 GC條件:載氣為氦氣；體積流量1.0℃/min；程序升溫，初始溫度60℃，4℃/min速率升至124℃，8℃/min速率升至196℃，保持5 min，10℃/min速率上升至260℃，保持5 min；分流進樣，分流比1∶60；進樣量1 μL；進樣口溫度250℃。MS條件: EI電離；電子能量70 eV；離子源溫度220℃；全掃描方式。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取S1樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項色譜條件下連續進樣6次，測定GC-MS色譜圖。結果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于5％，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取S1樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，測定GC-MS色譜圖。結果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于5％，表明溶液在24 h內穩定。

表2　砂仁揮發油鎮痛實驗結果（±s，n=1 0）Tab.2 Results of tests for the analgesla effect of essentlal oll from Amom i Fructus（±s，n=10）

表2　砂仁揮發油鎮痛實驗結果（±s，n=1 0）Tab.2 Results of tests for the analgesla effect of essentlal oll from Amom i Fructus（±s，n=10）

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　扭體次數　　鎮痛率/％模型組32.6±5.42　-陽性藥組　0　100 S1　23.6±8.15*　27.61 S2　29.0±9.84　11.04 S3　27.0±5.08　17.18 S4　23.6±8.40*　27.61 S5　25.1±10.49*　23.01 S6　22.9±10.58**　29.75 S7　27.8±6.03　14.72 S8　24.5±9.28*　24.85 S9　19.9±5.63**　38.96 S10　20.4±8.81**　37.42 S11　18.6±9.77**　42.94 S12　17.7±9.06**　45.71 S13　22.7±9.77**　30.37 S14　21.6±10.74**　33.74 S15　27.5±8.40　15.64 S16　21.1±6.44**　35.27 S17　24.8±7.54*　23.93 S18　30.4±6.87　6.75

2.3.3 重復性試驗 取S1樣品，按“2.2.1”項下方法平行制備5份供試品溶液，測定GC-MS色譜圖。結果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于5％，表明該方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜建立、分析及評價

2.4.1 測定與結果 取“2.2.1”項下制備的樣品，在“2.2.2”項色譜條件下分別進行GC-MS分析，測得18批砂仁揮發油的色譜圖，確定其中7個色譜峰為共有峰，其峰面積之和均占各樣品總峰面積的73.93％～97.00％，可較好地代表該樣品。進一步通過NIST08質譜數據系統檢索，并與標準圖譜比較分析，鑒定了共有色譜峰所代表的成分，結果見表3、圖1。

2.4.2 相對度分析 以S1廣東蟠龍的陽春砂仁為參照，采用Agi1ent GC-MSD工作站自帶的相似度分析軟件處理，得到18批砂仁藥材GC-MS指紋圖譜間的相似度。結果顯示，與S1比較，砂仁各樣品之間的相似度差異較大（0.338～0.983），見圖2。

表3　GC-MS指紋圖譜共有峰峰面積Tab.3 Peak areas of comm on peaks of GC-MS flngerprlnts

2.5 灰色關聯度分析 對18批砂仁揮發油GC-MS指紋圖譜共有峰峰面積的數據與鎮痛活性進行灰色關聯度分析，研究兩者之間的相關性。將不同批次砂仁揮發油的鎮痛藥效設為參考序列（母序列），7個共有峰設為比較序列（子序列），1～7個共有峰分別用x1～x7表示。參考文獻［8-10］的方法和步驟。

2.5.1 絕對差序列 采用均值化變換，即分別求出各個序列數據的平均值，再用其去除對應序列中各個原始數據，所得到的商為新的數據列，即均值化數列。經數據變換的母序列標記為{Yo（m）}，子序列記為{Yi（m）}，絕對差序列Δoi（m）= ∣Yo（m）-Yi（m）∣（1≤i≤m）

圖1　不同產地砂仁揮發油GC-MS指紋圖譜Flg.1 GC-M S flngerprlnts of essentlal oll from Amom i Fructus from dlfferent grow lng areas

圖2　不同產地砂仁揮發油GC-MS指紋圖譜相似度Flg.2 Slm llarltles of GC-MS flngerprlnts of essentlal oll from Amomi Fructus from d lfferent grow lng areas

2.5.2 關聯系數 關聯系數反映2個被比較序列的靠近程度。母序列與子序列的關聯系數記為Loi（k），Δmin和Δmax分別表示所有比較序列絕對差中的最小值與最大值；ρ為分辨系數，其意義是削弱最大絕對差數值太大所引起的失真現象，提高關聯系數之間的差異顯著性，取值在0～1之間，本實驗選取0.5。另外，關聯系數反映2個被比較序列的靠近程度。計算公式如下。

2.5.3 關聯度 關聯度按兩個比較序列的關聯系數均值計算。roi為子序列i與母序列o的關聯度，N為比較序列的數據個數。公式為roi=

2.5.4 關聯序 將m個子序列對同一母序列的關聯度按大小順序排列，即為關聯序，記為（x），它直接反映各個子序列對母序列的“貢獻”大小。據此，可尋找指紋特征峰對應的化學成分與藥效間的聯系。

2.5.5 譜效相關性分析 對砂仁揮發油指紋圖譜中各共有峰峰面積的數據與鎮痛活性進行灰色關聯度及關聯序分析。依據相對關聯度的大小，確定各成分對鎮痛作用的貢獻順序依次為x4＞x6＞x5＞x7＞x3＞x1＞x2，見表4。

表4　砂仁揮發油GC-MS圖譜與鎮痛作用的關系Tab.4 Relatlshlp between the GC-MS flngerprlnts of essentlal oll from Amomi Fructus and lts analgesla effect

3 討論

中藥的藥效物質基礎具有整體性、模糊性的特征，是有效物質群綜合作用的結果［9］，但因其所含成分復雜，故研究和表征難度很大，對其中部分指標成分的控制也難以真正評價其藥效與質量。中藥指紋圖譜可較全面地反映其所含化學成分的數量與含有量，但其表征的化學成分是否為藥效成分以及與藥效的相關程度不明確，難以體現兩者之間的關系［11-12］。近年來，通過將指紋圖譜與藥效評價相結合，研究兩者之間的相關性（即譜效關系）來尋找其藥效相關化學物質基礎，已逐漸成為探索中藥特定藥效物質基礎的主要方法和解決中藥質控指標與藥效研究脫節問題的有效手段［13］。灰色關聯度分析法作為對模糊系統研究的有效手段，適用于系統的信息量較少，但涉及的因素較多，而且這些因素往往相互影響、相互作用［14］，是構建譜效關系的常用分析方法之一，在相關研究中被廣泛運用［15-16］。

砂仁為中醫臨床常用藥，以廣東陽春縣產陽春砂的質量為最佳，尤以蟠龍山產者為第一，為道地產區［17］，研究顯示，揮發油是其主要藥效部位之一。本實驗采用GC-MS，對18批砂仁揮發油進行了分析，建立了指紋圖譜，確定其中7個色譜峰為共有峰，并明確其所代表的化學成分，各共有峰峰面積之和占總峰面積的73.93％～97.00％之間，可較好地表達該樣品所含的化學成分信息。進一步以蟠龍山產陽春砂樣品為基準，進行相似度研究，發現18批砂仁GC-MS指紋圖譜之間相似度較差，表明以揮發油為指標時，各砂仁樣品間的質量一致性較差，而且與品種、產地等因素無明顯相關性。

然后，采用灰色關聯度分析法研究了共有色譜峰與鎮痛活性之間的關系，發現兩者均有不同程度的關聯度（0.858～0.718）。其中，樟腦、乙酸龍腦酯與砂仁的鎮痛藥效關聯度較強，在0.800以上，為砂仁揮發油發揮鎮痛作用的重要物質基礎，另外龍腦、匙葉桉油烯醇和D-檸檬烯也有較高的關聯度，在0.750以上，這與文獻報道乙酸龍腦酯［18］、樟腦［19］、檸檬烯［20］和龍腦［21］具有鎮痛作用的研究結果一致。綜上所述，砂仁揮發油的鎮痛作用不僅是其中主要化學成分乙酸龍腦酯發揮功效，還受其它成分的影響，是多組分聯合效應的結果，但這些成分在砂仁鎮痛的過程中究竟起到了何種作用（簡單加和?相互協同?）還有待于作進一步的考察。結合前期研究發現，砂仁鎮痛活性的相關成分同時也具有抗炎活性，但與兩種藥理作用關系的密切程度有差異，故有必要在結合活性評價的結果，并明確其與砂仁主要功效關系密切程度的基礎上，引入多個指標，以更好地控制砂仁藥材的質量。

參考文獻:

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典: 2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010: 253.

［2］ 張明發，沈雅琴.砂仁臨床藥理作用的研究進展［J］.抗感染藥學，2013，10（1）: 8-13.

［3］ 付 琛，周日水，周光雄.不同產地品種陽春砂仁揮發油化學成分的氣相色譜-質譜聯用分析［J］.時珍國醫國藥，2010，21（10）: 2534-2536.

［4］ 趙 錦，董 志，朱 毅，等.海南砂仁揮發油抗炎鎮痛止瀉的實驗研究［J］.中成藥，2009，31（7）: 1010-1014.

［5］ 葉 強，李生茂，敖 慧，等.不同產地綠殼砂仁揮發油組分比較［J］.中成藥，2014，35（5）: 1033-1037.

［6］ 陳 璐，敖 慧，葉 強，等.陽春砂仁不同部位揮發油成分的GC-MS分析［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20 （14）: 65-68.

［7］ 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學［M］.3版.北京:人民衛生出版社，2001: 883.

［8］ 于 萍，李 克.使用Microsoft Exce1進行數據的灰關聯分析［J］.微型電腦應用，2011，27（3）: 29-37.

［9］ 朱詩塔，雷 鵬，李新中，等.掌葉大黃不同炮制品指紋圖譜與其止血作用的灰關聯度分析［J］.中南藥學，2009，7（1）: 55-58.

［10］ 石俊英，張會敏，王 穎，等.山東道地藥材金銀花HPLC指紋圖譜研究［J］.山東中醫藥大學學報，2008，32 （1）: 69-73.

［11］ 霍仕霞，康雨彤，彭曉明，等.高良姜提取物促進黑素生成的譜效關系分析［J］.中草藥，2013，44（8）: 995-1002.

［12］ 劉 莉，李文蘭，丁晶鑫.基于“譜-效”相關的中藥藥效物質基礎研究方法［J］.天然產物研究與開發，2013，25 （3）: 410-415.

［13］ 羅國安，王義民，曹 進，等.建立我國現代中藥質量標準體系的研究［J］.世界科學技術:中醫藥現代化，2002，4（4）: 5-11.

［14］ 曾建紅，莫炫永，戴 平，等.廣西莪術揮發油抗腫瘤作用的譜效關系研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18 （13）: 91-94.

［15］ 秦昆明，鄭禮娟，沈保家，等.譜效關系在中藥研究中的應用及相關思考［J］.中國中藥雜志，2013，38（1）: 26-31.

［16］ 陳華國，周 欣，趙 超，等.馬蘭草抗炎活性部位量效關系及高效液相色譜-效關系研究［J］.中國藥學雜志，2013，48（14）: 1190-1193.

［17］ 陳彩英，詹若挺，王小平.砂仁品種、種質資源的考證溯源［J］.山東中醫藥大學學報，2011，35（4）: 354-357.

［18］ 吳曉松，李曉光，肖 飛，等.砂仁揮發油中乙酸龍腦酯鎮痛抗炎作用的研究［J］.中藥材，2004，27（6）: 438-439.

［19］ 熊 穎，吳雪茹，涂興明，等.樟腦的藥學研究進展［J］.檢驗醫學與臨床，2009，6（12）: 999-1001.

［20］ 王梅蘭，林建交，陳雅容.檸檬烯對小白鼠中樞神經系統的影響［J］.海峽藥學，2005，17（4）: 30-32.

［21］ 江光池，馮旭軍，黃 嵐，等.龍腦和異龍腦對小鼠和家兔的藥理作用［J］.華西藥學雜志，1989，4（1）: 23-25.

Relatlonshlp between the GC-MS flngerprlnts of essentlal oll from Amom i Fructus and lts analgesla effect

LISheng-mao1， YE Qiang2， AO Hui2 *
（1.School of Pharmacy，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，China；2.Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China）

ABSTRACT:AIM To study the re1ationshiP between the gas chromatograPhy-mass sPectrometry（GC-MS）fingerPrints of essentia1oi1 from Amomi Fructus and its ana1gesia effect.METH0DS The fingerPrints of eighteen batches of essentia1oi1 from Amomi Fructus from different growing areaswere estab1ished by GC-MS.The ana1gesia effectwas tested by frequency body torsion caused by acetic acid in mice.The re1ationshiP between fingerPrints and ana1gesia effectwas ana1yzed by grey corre1ation.RESULTS There were seven common Peaks in GC-MS finger-Prints.A11 the common Peaks had a certain corre1ation with the ana1gesia effect（0.858 -0.718）with the rank of camPhor＞borny1acetate＞borneo1＞sPathu1eno1＞D-1imonene＞camPhene＞myrcene.C0 NCLUSI0 N The ana1gesia effect of essentia1oi1 from Amomi Fructus is the resu1t ofmu1ticomPonent combined effect.

*通信作者:敖 慧（1980—），女，博士，高級實驗師，從事中藥藥理與中藥質量控制研究。Te1:（028）61800192，E-mai1: aohui2005 @126.com

作者簡介:李生茂（1981—），男，博士，講師，從事中藥藥效物質基礎及質量標準化研究。Te1:（0817）3300337，E-mai1: 1sm9110 @163.com

基金項目:成都中醫藥大學科技發展基金項目（ZRVI5201271）；成都中醫藥大學實驗技術項目（13117）；四川省中醫藥管理局青年中醫藥課題（2014K090）

收稿日期:2015-06-08

中圖分類號:R284.1

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0346-05