星點設計-效應面法優(yōu)化鹽巴戟炮制工藝

黃玉秋， 范亞楠， 賈天柱，2，3， 張明璇， 邱一鋆， 史 輯，2，3*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600；2.國家中醫(yī)藥管理局炮制原理解析重點實驗室，遼寧大連116600；3.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧大連116600）

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星點設計-效應面法優(yōu)化鹽巴戟炮制工藝

黃玉秋1， 范亞楠1， 賈天柱1，2，3， 張明璇1， 邱一鋆1， 史 輯1，2，3*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600；2.國家中醫(yī)藥管理局炮制原理解析重點實驗室，遼寧大連116600；3.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧大連116600）

摘要:目的 優(yōu)化鹽巴戟的炮制工藝。方法 在單因素試驗基礎上，以加水量、悶潤時間、蒸制時間為自變量，耐斯糖、甲基異茜草素-1-甲醚、水晶蘭苷的綜合評分為評價指標，通過星點設計-效應面法優(yōu)選鹽巴戟的炮制工藝。結(jié)果最佳炮制工藝為加水1.05倍，悶潤5.48 h，蒸制2.90 h（100 g巴戟肉加鹽1.5 g），測量值和預測值之間的相對誤差為3.04％。結(jié)論 該方法得到的炮制參數(shù)準確，重復性好，有一定實際意義。

關鍵詞:鹽巴戟；耐斯糖；甲基異茜草素-1-甲醚；水晶蘭苷；星點設計-效應面法

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.028

KEY W 0RDS: sa1ted Morinda officinalis；nystose；rubiadin-1-methy1ether；monotroPein；centra1 comPosite design-resPonse surfacemethodo1ogy

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效［1］。其中，鹽巴戟是巴戟天臨床應用最廣泛的炮制品種，經(jīng)鹽制后專入腎經(jīng)，溫而不燥，補腎壯陽、強筋骨作用增強［2］，但藥典未對其炮制工藝作嚴格規(guī)定，而且文獻報道不一［3-6］，致使鹽巴戟的內(nèi)在質(zhì)量有較大差異。本實驗以單因素試驗為基礎，采用星點設計-效應面法對鹽巴戟的炮制工藝進行優(yōu)化，旨在為其質(zhì)量評價及臨床應用提供科學依據(jù)。

星點設計（centra1 comPosite design，CCD）是一種多因素5水平的設計方法，與常用的正交設計法相比，不但具有非線性擬合的特點，而且其結(jié)果可以用效應面法（resPonse surface method，RSM）進行優(yōu)化，能較好地對因變量與自變量的關系進行描述，使最佳試驗條件在一個更小的范圍內(nèi)。該方法精密度高，預測值與真實值更接近，而且所用實驗次數(shù)少，目前在制劑工藝和處方優(yōu)化中較常用，但鮮見于炮制工藝的篩選［7-10］。本實驗將星點設計-效應面法應用到鹽巴戟的炮制中，以優(yōu)選出理想的炮制工藝。

1 儀器與材料

LC-20A型高效液相色譜儀，包括SPD-M20A檢測器、SIL-20A自動進樣器、CBM-20A系統(tǒng)控制器、LC-20AB泵、LC So1ution LC工作站（日本島津公司）；Corona CAD電霧式檢測器（美國ESA公司）；E2695-2998型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；FA1004型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；AE240型電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；100 g手提式高速萬能粉碎機（浙江溫嶺市林大機械有限公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（250 W、40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱（上海市躍進醫(yī)療器械一廠）。

巴戟天藥材購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根。

耐斯糖對照品（批號292-64121，純度≥99.0％，日本W(wǎng)ako公司）；水晶蘭苷對照品（批號MUST-11062204，純度≥98.0 ％，成都曼斯特生物科技有限公司）；甲基異茜草素-1-甲醚（自制，純度＞95 ％）。食鹽（延吉高麗亞食品經(jīng)銷部）；水為超純水；乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材的準備 巴戟天用1.0倍量水浸泡，50℃下悶潤9 h，去除木心，切段10～15 mm，干燥。然后，以此工藝得出的巴戟肉來制備鹽巴戟。

2.2 耐斯糖的含有量測定［1，11-12]

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取耐斯糖對照品128 mg，甲醇∶水（3∶97）定容至500 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.2.2 色譜條件 Ecosi1C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 mm），包括Corona CAD電霧式檢測器；流動相為甲醇∶水（3∶97）；體積流量1.0 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30℃，見圖1。

2.2.3 供試品溶液的制備及樣品測定 精密稱取不同炮制方法制得的鹽巴戟粉末（過60目篩）0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入乙酸乙酯30 mL，超聲（250 W、40 kHz）處理30 min，過濾，棄去濾液，揮干，濾渣再加70％乙醇50 mL，相同條件下超聲處理，過濾，回收乙醇，用甲醇-水（3∶97）定容至25 mL量瓶中，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。在“2.2.2”項條件下進行操作，測得峰面積，計算含有量。

2.3 水晶蘭苷的含有量測定［12]

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取水晶蘭苷對照品15.8 mg，80％甲醇定容至50 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.3.2 色譜條件 Venusi1 MP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流動相為甲醇-0.1 ％磷酸水溶液，梯度洗脫（5∶95→28.8∶71.2，15 min）；檢測波長235 nm；體積流量0.8 mL/min；進樣量2 μL；柱溫25℃，見圖2。

2.3.3 供試品溶液的制備及樣品的測定 精密稱取不同炮制方法制得的鹽巴戟粉末（過60目篩）1 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入80％甲醇100 mL，冷浸1 h，超聲（250 W、40 kHz）處理1 h，過濾，80 ％甲醇定容至10 mL量瓶中，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。在“2.3.2”項條件下進行操作，測得峰面積，計算含有量。

2.4 甲基異茜草素-1-甲醚的含有量測定［13]

2.水晶蘭苷2.monotroPein圖2　水晶蘭苷對照品及樣品的H P L C色譜圖Flg.2 HPLC chromatograms of monotropeln reference substance and samp le

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取甲基異茜草素-1-甲醚對照品2.93 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得。

2.4.2 色譜條件 Ecosi1C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 mm）；流動相為乙腈-0.2％磷酸水溶液，梯度洗脫（20∶80→42∶58，15 min；60∶40 →95∶5，5 min）；檢測波長277 nm；體積流量1.0 mL/min；進樣量20 μL；柱溫30℃，見圖3。

3.甲基異茜草素-1-甲醚3.rubiadin-1-methy1ether圖3　甲基異茜草素-1-甲醚對照品及樣品的HP LC色譜圖Flg.3 HPLC chromatograms of rubladln-1-methylether reference substance and sample

2.4.3 供試品溶液的制備及樣品的測定 稱取不同炮制方法制得的鹽巴戟粉末（過60目篩）2 g，置于150 mL圓底燒瓶中，加氯仿80 mL，回流提取兩次，每次2 h，合并濾液，甲醇定容至10 mL量瓶中，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。在“2.4.2”項色譜條件下，得到相應的峰面積，計算含有量。

2.5 單因素試驗

2.5.1 加鹽量 取“2.1”項下巴戟肉5份，每份30 g，分別加入0.3、0.45、0.6、0.75、0.9 g鹽進行炮制，按上述方法測得耐斯糖、水晶蘭苷、甲基異茜草素-1-甲醚的含有量，以加權(quán)綜合評分OD值為指標進行評價（綜合評分OD=0.4X/Xmax+0.3Y/Ymax+0.3Z/Zmax，X為耐斯糖測定值，Y為水晶蘭苷測定值，Z為甲基異茜草素-1-甲醚測定值，Xmax、Ymax、Zmax分別為各自對應的最大測定值），滿分是1.0分。結(jié)果，綜合評分OD值分別為0.848、0.933、0.864、0.765、0.792分，故藥材加鹽0.45 g最好。

2.5.2 加水量 取“2.1”項下巴戟肉5份，每份30 g，各加鹽0.45 g，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0倍量的水進行炮制，HPLC法測得3種指標性成分的含有量，按“2.5.1”項下方法進行評價。結(jié)果，OD值在加水量為1.0倍量時最高，而且低于0.8倍量時，藥材不能完全軟化，故在星點設計時，中值水平設定為1.0倍量。

2.5.3 悶潤時間 取“2.1”項下巴戟肉5份，每份30 g，加1.5 ％鹽水30 mL，分別悶潤3、4、5、6、7 h后，再蒸制2 h，干燥，對不同悶潤時間進行篩選，發(fā)現(xiàn)悶潤5 h效果最好。另外，當悶潤時間低于4 h時，水分剩余較多，不能完全吸收，故在星點設計時，將悶潤時間的最小水平設定為4 h。

2.5.4 蒸制時間 取“2.1”項下巴戟肉5份，每份30 g，加1.5 ％鹽水30 mL，悶潤5 h，分別蒸制0.5、1、1.5、2、3 h，干燥，HPLC法測得3種指標性成分的含有量，計算綜合OD值。結(jié)果，最佳蒸制時間為3 h。

2.6 星點設計效應面法優(yōu)化制備工藝

2.6.1 星點設計試驗 在單因素試驗的基礎上，根據(jù)星點設計原理，選擇加水量（A，倍）、悶潤時間（B，h）、蒸制時間（C，h）作為考察因素，每個因素設定5個水平，以加權(quán)綜合評分OD值為指標（計算方法同“2.5.1”項）。試驗因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

表2　試驗結(jié)果Tab.2 Results of tests

2.6.2 模型擬合 根據(jù)試驗結(jié)果，用Design-Ex-Pert.V8.0.6.1軟件并以總評OD值為因變量，對自變量進行回歸分析，得到回歸方程Y=-15.200 6 +14.067 4A+1.912 9B+2.427 3C-0.068AB+ 0.539 7AC+0.015 6BC-7.297 8A2-0.172 2B2-0.53C2（r=0.912 6，P=0.000 3），r較大，說明模型擬合度高，預測性較好。方差分析見表3，可見A（加水量）和C（蒸制時間）對總評OD值的影響較為顯著（P＜0.05）。

表3　方差分析Tab.3 Analysls of varlance

2.6.3 效應面優(yōu)化與預測性評價 根據(jù)所擬合的回歸方程，應用Design-ExPert.V8.0.6.1軟件，分別繪制總評OD值與影響較顯著的兩個因素的三維效應面，確定最佳工藝區(qū)域，篩選最佳炮制工藝，見圖4。

圖4　各因素的三維效應面Flg.4 Three-d lmenslonal response surfaces of varlous factors

由圖可知，在A、B兩個因素中，隨著A（加水量）的增加，曲面慢慢變得陡峭，而B（悶潤時間）對曲面影響較小，隨著其改變，曲面較平滑；在A、C兩個因素中，隨著兩者的增加，總評OD值也在增加，直到達到一個最大值；B、C兩因素跟A、C較相似。由此表明，A和C影響較顯著，而B影響較小。

2.6.3 驗證試驗 采用Design-ExPert.V8.0.6.1軟件計算，結(jié)合生產(chǎn)實際，得出鹽巴戟的最佳炮制工藝為加水1.05倍量，悶潤5.48 h，蒸制2.90 h （100 g巴戟肉加鹽1.5 g）。按照篩選出的最優(yōu)炮制工藝條件重復3次，得出平均實際測定值（0.913 9），與理論預測值（0.942 6）的相對誤差為3.04％（相對誤差=［預測值-實際值］/預測值），小于5％，說明星點設計-效應面法得到的鹽巴戟炮制工藝技術參數(shù)準確可靠，重復性好，可用于實際生產(chǎn)。

3 討論

鹽巴戟的補腎壯陽、強筋骨作用相比巴戟肉有所增強，原因是其在炮制過程中，化學成分發(fā)生了變化。目前認為，巴戟天寡糖具有補腎壯陽、抗衰老、抗抑郁以及提高細胞免疫的功能，而耐斯糖是其中含有量較高的成分，《中國藥典》2010版中就是以耐斯糖的含有量變化來評價巴戟天質(zhì)量的優(yōu)劣。另外，巴戟天中具有抗風濕作用的環(huán)烯醚萜苷類成分，如水晶蘭苷等具有明確的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，而甲基異茜草素-1-甲醚等茜草素型蒽醌可能是其發(fā)揮補益作用的物質(zhì)基礎。由于巴戟天經(jīng)鹽蒸后，耐斯糖、水晶蘭苷、甲基異茜草素-1-甲醚的含有量均有所增加［12］，因此以這3個成分為指標，對鹽巴戟炮制工藝進行優(yōu)化，客觀科學地評價其飲片質(zhì)量，提高其在臨床上的藥效。

本實驗選擇星點設計-效應面法，用非線性數(shù)學模型對模型進行擬合，用三維效應面進行優(yōu)化，可直接看出最佳效應區(qū)域。該方法具有較高的可靠性，得到的最佳工藝條件穩(wěn)定精密，而且重復性好，比常用的正交設計更直觀形象，說明其應用于巴戟天的炮制工藝研究是有效可行的。

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0 ptlm lzatlon of the processlng procedure of salted Morinda officinalis by central com poslte deslgn-reponse surfacemethodology

HUANG Yu-qiu1， FAN Ya-nan1， JIA Tian-zhu1，2，3， ZHANG Ming-xuan1， QIU Yi-yun1，SHI Ji1，2，3*
（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China；2.Key Laboratory of Processing PrinciPle Analysis，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China；3.Liaoning Research Center of Processing Engineering Technology for Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

ABSTRACT:AIM To oPtimize the Processing Procedure of sa1ted Morinda officinalis.METH0 DS On the basis of sing1e factor exPeriment，water addition，moistening time and steaming time were taken as indePendent variab1es.The comPrehensive scores of nystose，rubiadin-1-methy1ether and monotroPein were taken as eva1uation indexes.Then centra1 comPosite design-resPonse surface methodo1ogy was aPP1ied to oPtimizing the Processing Procedure of sa1ted Morinda officinalis.RESULTS The oPtimized Processing Procedure was 1.05 times forwater addition，5.48 hours formoistening time and 2.9 hours for steaming time（100 g Morinda officinalis was added with 1.5 g sa1t）.The re1ative error between themeasured va1ue and forecast va1uewas3.04％.C0NCLUSI0N The Processing Parameters obtained by thismethod are accuratewith good reProducibi1ity，having a certain Practica1significance.

*通信作者:史 輯（1977—），女，副教授，碩士生導師，從事中藥炮制化學研究。Te1:（0411）85890146，E-mai1: 1nshiji@ 163.com

作者簡介:黃玉秋（1989—），女，碩士，從事中藥炮制原理研究。Te1:（0411）85890157，E-mai1: hyq198996@126.com

基金項目:國家自然科學基金青年基金（81001635）；國家自然科學基金（81473350）

收稿日期:2015-06-29

中圖分類號:R283

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0361-05