固本防哮飲對幼齡小鼠哮喘緩解期模型IKK/IκB/NF-κB信號途徑的調節作用

袁雪晶， 曹建梅， 許慧潔

（南京中醫藥大學附屬醫院兒科，江蘇南京210029）

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固本防哮飲對幼齡小鼠哮喘緩解期模型IKK/IκB/NF-κB信號途徑的調節作用

袁雪晶， 曹建梅， 許慧潔

（南京中醫藥大學附屬醫院兒科，江蘇南京210029）

摘要:目的 觀察固本防哮飲對幼齡哮喘緩解期小鼠IKK/IκB/NF-κB信號途徑的影響。方法 采用幼齡BALB/c小鼠，雞卵蛋白腹腔注射和霧化吸入致敏，并多次霧化吸入激發的方法建立幼齡哮喘緩解期小鼠模型。造模成功后給藥4周，測小鼠氣道阻力、HE染色觀察小鼠肺組織病理變化、肺泡灌洗液細胞計數和細胞分類、Western b1ot法檢測肺組織和外周血單個核細胞中IκB激酶β（IKKβ）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、核因子-κB（NF-κB）P65蛋白表達。結果 固本防哮飲可以降低幼齡哮喘緩解期小鼠的氣道阻力、降低肺泡灌洗液（BALF）中細胞總數，降低BALF中中性粒細胞和單核細胞比例（P＜0.05，P＜0.01），改善支氣管周圍炎性細胞浸潤，減輕氣道重塑，并能增加肺組織和

關鍵詞:固本防哮飲；哮喘緩解期；氣道高反應性；炎性細胞侵潤；IKK/IκB/NF-κB通路

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.038

支氣管哮喘是一種炎癥細胞、炎癥介質以及細胞因子共同參與的慢性氣道非特異性炎癥性疾患，是兒童時期的多發病、常見病，此病的發病率正逐年上升［1-2］。目前尚無能夠根治哮喘的藥物，中醫藥治療哮喘具有良好療效［3-4］。固本防哮飲處方是著名兒科專家江育仁教授針對哮喘緩解期治療的經驗方，前期多中心隨機對照研究已證實其臨床應用能夠延長哮喘緩解天數，減少哮喘發作次數，改善患兒生存質量，實驗研究也證實其能通過調節機體Th1/Th2細胞的平衡，減輕氣道炎癥和氣道重塑［5-6］。

近來許多研究表明，核因子-κB（nuc1ear factor kaPPaB，NF-κB）通路可介導多種免疫細胞的增殖、分化和炎癥因子的產生［7］。這條通路的活化與炎癥性的自身免疫性疾病相關，包括支氣管哮喘［8］。NF-κB抑制蛋白（inhibitor of nuc1ear factor kaPPa-B，IκB）可以抑制NF-κB的活性［9-10］。IκB激酶家族（the IkaPPaB kinases，IKKs）作為NF-κB信號途徑的關鍵成員，能解除IκB對NF-κB的抑制，激活參與應激反應和免疫細胞活化、增殖、分化、凋亡等多種相關基因轉錄的調控。

本次研究中我們使用幼齡BALB/c小鼠，采用卵蛋白致敏引起的慢性過敏性氣道炎癥哮喘模型，觀察固本防哮飲對哮喘模型小鼠氣道反應性、BALF炎癥細胞計數、肺臟組織病理學以及對IKK/IκB/NF-κB信號途徑的影響。

1材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 清潔級BALB/c雌性小鼠，3～4周齡，體質量13～20 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產許可證: SCXK（滬）2009-0001。適應飼養3 d。

1.1.2 藥物 固本防哮飲由炙黃芪、黨參、白術、茯苓、煅牡蠣、蟬蛻、陳皮、防風、辛夷、五味子和生甘草11味藥組成，將上述11味藥按比例5∶3.3∶3.3∶3.3∶5∶2∶2∶1∶2∶2∶1配伍，然后取8倍量冷水浸藥30 min，煎30 min（沸后），濾過；第2煎加6倍量水煎30 min，將2次煎液濾過，合并濃縮調至含生藥2 g/mL的溶液，密封于無菌量瓶，4℃儲存備用。藥物由江蘇省中醫院藥劑科加工制備和質控。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 卵蛋白（OVA）（批號0009006591）、氯化乙酰膽堿（批號137751）、硫酸鉀鋁（批號1416173）均購自美國Sigma公司；Trizo1（批號15596-026）購自美國Invitrogen公司；PMSF（苯甲基磺酰氟）、AProtinin購自南京生興生物技術公司；蛋白定量試劑盒（Bio-Rad DC Protein Assay Kit）為Bio-Rad公司產品；GAPDH抗體（批號KC-5G5）購自美國Stanta cruz公司；過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國KPL公司；ECL購自瑞典Amersham公司；IKKβ Antibody（批號2684）、IκBαAntibody（批號9242）、NF-κB P65（C22B4）RabbitmAb（批號4764）購自美國CST公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（批號2J162J16）、甘氨酸（批號2L262L26）、丙烯酰胺（批號2E252E25）、雙丙烯酰胺（批號9F039F03）、十二烷基硫酸鈉（SDS）（批號9L212C09）、過硫酸銨（批號0J110J11），以上試劑均購自南京生興生物技術有限公司；瓊脂糖（批號0000190547）購自美國Invitrogen公司；脫脂奶粉（批號2048823）購自美國BD公司。

1.2.2 儀器 動物肺功能體描箱、呼吸機及AniRes 2005軟件分析系統均由北京鑫奧成科技有限公司提供；S-888E型超聲霧化器由南京道芬電子有限公司生產，配套裝置是一個體積約22 cm×22 cm×50 cm的有機玻璃盒；C1iniBio 128D型酶標儀為奧地利ASYS Hitech公司產品；SORVALL低溫離心機為德國Biofuge stratos公司產品。JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機為寧波新芝生物科技有限公司產品；Western電泳儀為美國Bio-Rad公司產品；病理石蠟切片機為德國（SLEE）MNT公司產品；醫用X光片購自美國Kodak公司；電轉儀為美國Bio-Rad公司產品；Power Pac Basic凝膠成像及分析系統為美國Bio-Rad公司產品；垂直平板微電泳槽、直流穩壓電泳儀為北京市六一儀器廠產品；

1.3 動物造模方法 幼齡小鼠哮喘緩解期模型建立:參考文獻及前期實驗方法，略加改進［6，11-12］。采用BALB/c乳鼠，適應性飼養2～3 d后，除正常組外，小鼠予腹腔注射卵蛋白致敏，卵蛋白用硫酸鉀鋁混合，在第1天和第11天致敏（OVA 100 μg/只），同時第11天霧化吸入卵蛋白（5 mg/m L）30 min致敏，從第19日開始，小鼠放入霧化器的有機玻璃盒中，以卵蛋白（1 mg/mL）霧化吸入30 min激發，每2周為一個激發周期，每個激發周期激發2次，2次激發為連續2日，共完成6個激發周期，第90日為末次激發。對照組小鼠以生理鹽水致敏和激發。

1.4 分組和給藥 末次激發后第2天，將模型小鼠隨機分為4組，即模型組和固本防哮飲6.5、13、26 g（生藥）/kg組。受試藥物從第90日開始給藥，每日灌胃1次，共給藥28日。正常組和模型組均以等體積的0.9％的氯化鈉溶液灌胃。

1.5 檢測指標

1.5.1 氣道反應性測定 使用小動物肺功能分析系統測定乙酰膽堿激發的氣道高反應性［12-13］。小鼠末次給藥24 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，分離氣管，剪開一小口，插入一2 mm塑料管，固定插管，連接于動物肺功能儀；用4號頭皮針做尾靜脈穿刺，并連接含乙酰膽堿的注射器備用；將小鼠置于密閉的體描箱中，按呼吸頻率90次/min、潮氣量5～6 mL/kg調整呼吸機參數；等小鼠氣道壓力穩定后，從低劑量逐漸遞增尾靜脈給予乙酰膽堿（11、33、100、300 μg/mL）0.1 mL；記錄每次給予相應劑量的乙酰膽堿后5 s到1 min的數據，利用AniRes 2005分析軟件計算最大肺阻力（RL）。

1.5.2 肺泡灌洗液（BALF）中細胞計數 在環狀軟骨上用血管鉗固定氣管，其下做橫行切口，26G針頭置入，固定，用0.4 mL PBS進行肺泡灌洗，每次灌洗后立即回收BALF置于離心管中，計回收率，于4℃儲存，2 h內作細胞分離。BALF于1 000×g離心10 min，上清液置-70℃保存。沉淀細胞重懸，吹打均勻后取0.1 mL于血細胞計數臺測定細胞總數，取0.2 mL涂片、甲醇固定、Wright's染色的方法計數，至少數200個細胞作細胞分類計數。

1.5.3 肺組織病理學觀察 行支氣管肺泡灌洗后，打開胸腔，取右側肺組織4％多聚甲醛固定，酒精脫水，石蠟切片后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察氣道壁厚度和肺組織的炎性改變等病理變化。取左側肺組織進行蛋白檢測。

1.5.4 小鼠肺組織IKKβ、IκBα、NF-κB P65蛋白檢測

采用Western b1ot法檢測小鼠肺組織IKKβ、IκBα、NF-κB P65蛋白表達。用10倍體積于組織體積的RIPA裂解液對組織進行勻漿，收集上清液，用BCA法測定蛋白水平，將蛋白統一稀釋成3 mg/mL，再加入3×1oading buffer及1/20體積的巰基乙醇，制成蛋白上樣液，沸水浴5 min后，-20℃冰箱凍存。用該樣品進行Western b1ot檢測，點樣前均要再沸水浴5 min。取30 μL樣品，進行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳。待分離膠凝集后，配制5％濃縮膠。倒入5％濃縮膠后，插入預先準備好的梳子。待膠凝集好后，上樣，進行電泳分離蛋白，上層膠用85 V電壓電泳，當樣品至分離膠時，改用130 V電壓電泳。一般電泳時間在1.5 h左右。然后將蛋白質從凝膠轉至PVDF膜上，半干法轉膜。PVDF膜在5％的Mi1k（TBST溶解）封閉液中室溫搖動2 h。按相應比例稀釋好相應抗體，將稀釋好的抗體和膜一起孵育，4℃冰箱過夜。用TBST（Tris鹽緩沖液含0.05％ Tween-20）洗一抗，洗滌3次，每次5 min。孵育相應二抗（按1∶5 000，用TBST溶解）3 h（搖床）。用TBST洗二抗，洗滌3次，每次5 min。將ECL的A和B兩種試劑吸出，在EP管內等體積混合，然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應1～2 min后，將PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后轉移到在X片夾中預先鋪好的保鮮膜上一側，把另一側翻過來蓋在其上。根據信號的強弱適當調整曝光時間，然后顯影、定影，掃描膠片，分析結果。

1.5.5 小鼠外周血單個核細胞中IKKβ、IκBα、NF-κB P65蛋白檢測 小鼠眼眶取血，肝素抗凝，離心分離血漿后，將全血用Hank's液倍比稀釋，采用Fico11密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。將稀釋后的全血緩慢疊加于分離液上，保持液體界面清晰，水平離心（2 000 r/min）20 min，吸取中間白色單個核細胞層，Hank's液洗滌2次，用Hank's液重懸，臺酚藍染色計數，使細胞計數為1× 106/mL。超聲破碎細胞，提取總蛋白，用Western b1ot法測定外周血單個核細胞IKKβ、IκBα、NF-κB P65蛋白水平（方法同“1.5.4”項）。

2 統計學方法

實驗數據運用SPSS 17.0軟件進行統計分析，統計描述采用均數±標準差表示，統計推斷進行單因素方差分析，并運用LSD法進行兩兩比較，P＜0.05認為具有顯著性差異。

3 結果

3.1 對幼齡哮喘緩解期小鼠氣道反應性的影響 肺功能檢測結果顯示各組小鼠的肺阻力（RL）基礎值無明顯差異。氯化乙酰膽堿激發后模型組氣道阻力顯著高于正常對照組，固本防哮飲可以劑量依賴性降低氯化乙酰膽堿激發后小鼠肺阻力（RL）（P＜0.05，P＜0.01），降低氣道反應性。結果見表1。

表1　固本防哮飲對幼齡哮喘緩解期小鼠氣道反應性（RL）的影響［±s，n=5，cmH20/（mL·s），1 cmH20=0.1 k Pa］

表1　固本防哮飲對幼齡哮喘緩解期小鼠氣道反應性（RL）的影響［±s，n=5，cmH20/（mL·s），1 cmH20=0.1 k Pa］

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

11　33　100　300正常對照組　　—　1.48±0.46　1.80±0.42*　2.31±1.10**　3.05±2.61**　3.78±2.92**模型組　　—　1.42±0.72　6.69±4.29　13.43±6.47　16.85±5.49　19.80±4.21固本防哮飲低劑量組　6.5　1.48±0.39　3.29±1.36　5.59±1.83*　9.87±2.68*　13.56±2.85*固本防哮飲中劑量組　13　1.33±0.37　2.57±1.63　2.98±1.40**　6.33±4.00**　10.61±3.52**固本防哮飲高劑量組　26　1.34±0.31　2.07±0.62*　2.53±0.37**　3.33±1.11**　5.84±2.19組別　　劑量/ （g·kg-1）乙酰膽堿/（μg·mL-1）0 **

3.2 對幼齡哮喘緩解期小鼠BALF細胞計數和細胞分類的影響 模型組小鼠細胞計數顯著高于正常對照組，且細胞分類計數中，嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和單核細胞也顯著高于正常對照組（P＜0.05）。固本防哮飲可以降低BALF中細胞總數和中性粒細胞、單核細胞百分率（P＜0.05，P＜0.01），提示給予固本防哮飲后，可以減輕模型小鼠的炎性細胞浸潤。結果見表2。

3.3 對幼齡哮喘緩解期小鼠肺組織病理改變的影響 對照組小鼠肺臟未見炎細胞浸潤，支氣管壁完整，黏膜未見充血水腫，管壁和平滑肌厚度正常；而模型組小鼠肺臟可見氣道上皮不完整，氣道黏膜水腫明顯及平滑肌增生、增厚，周圍見有大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞和嗜酸性粒細胞為主。給予固本防哮飲后，小鼠肺臟病理改變顯著改善，氣道黏膜水腫明顯減輕，平滑肌厚度顯著減小，炎性細胞浸潤也顯著減輕，表明固本防哮飲可以改善哮喘小鼠的氣道病理進展。結果見圖1。

表2　固本防哮飲對幼齡哮喘緩解期小鼠BA L F細胞計數以及細胞分類的影響（±s，n=5）

表2　固本防哮飲對幼齡哮喘緩解期小鼠BA L F細胞計數以及細胞分類的影響（±s，n=5）

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　劑量/ （g·kg-1）炎性細胞總數/ （×104·mL-1）　　中性粒細胞/％　　嗜酸性粒細胞/％　　淋巴細胞/％　　單核細胞/％正常對照組　　—　42.40±14.29**　9.36±3.48*　2.28±0.39*　65.70±9.99　0.86±0.38*模型組　　—　78.80±11.90　20.80±11.42　3.94±1.43　61.48±11.65　 11.76±7.32固本防哮飲低劑量組　6.5　51.60±19.23*　12.88±7.66　4.96±5.08　53.10±14.00　1.80±1.14*固本防哮飲中劑量組　13　35.20±16.10**　13.98±7.13　4.34±2.65　45.66±7.14　2.80±1.18*固本防哮飲高劑量組　26　49.00±23.09*　11.38±2.99*　2.90±0.83　69.04±18.11　2.58±2.46*

圖1　各組小鼠肺組織HE染色病理圖片（×2 0 0）

3.4 對幼齡哮喘緩解期小鼠肺IKKβ、IκBα、NF-κB P65蛋白表達的影響 采用Western b1ot法對各組IKKβ、IκBα、NF-κB P65（C22B4）蛋白表達檢測，結果發現，在相對分子質量為87、39、65、36 kDa區域分布出現目的條帶，分別是IKKβ、IκBα、NF-κB P65（C22B4）和內參GAPDH（見圖2）。

1.正常對照組 2.模型組 3固本防哮飲低劑量組4.固本防哮飲中劑量組 5.固本防哮飲高劑量組圖2　各組肺組織IKKβ、IκBα、NF-κBp 6 5 （C22B4）蛋白表達

通過對目的條帶的定量分析，模型組和正常對照組比較IKKβ、NF-κB P65（C22B4）表達均明顯增高（P＜0.05），IκBα表達顯著降低（P＜0.01）。給藥后與模型組比較，固本防哮飲中、高劑量組IKKβ表達顯著降低（P＜0.05）；固本防哮飲各劑量組NF-κB P65（C22B4）表達均顯著降低，其中固本防哮飲中、高劑量組降低更為明顯（P＜0.01）；而固本防哮飲中、高劑量組IκBα表達量增加（P＜0.05）。結果見表3。

3.5對幼齡哮喘緩解期小鼠外周血單個核細胞中IKKβ、IκBα、NF-κB P65 (C22B4)蛋白表達的影響 采用Western b1ot法對各組IKKβ、IκBα、NF-κB P65（C22B4）蛋白表達檢測，結果發現，在相對分子質量為87、39、65、36 kDa區域分布出現目的條帶，分別是IKKβ、IκBα、NF-κB P65

（C22B4）和內參GAPDH（見圖3）。

1.正常對照組 2.模型組 3.固本防哮飲低劑量組4.固本防哮飲中劑量組 5.固本防哮飲高劑量組圖3　各組外周血單個核細胞中I KKβ、IκBα、NF-κB p65（C22B4）蛋白表達

通過對目的條帶的定量分析，模型組和正常對照組比較IKKβ、NF-κB P65（C22B4）表達均明顯增高（P＜0.01），IκBα表達顯著降低（P＜0.05）。給藥后與模型組比較，固本防哮飲低、中、高3個劑量組IKKβ表達顯著降低（P＜0.01）；固本防哮飲中、高劑量組NF-κB P65 （C22B4）表達顯著降低（P＜0.05）；而固本防哮飲高劑量組IκBα表達量顯著增加（P＜0.05）。結果見表4。

4 討論

為了制備一種更符合兒童哮喘特點的哮喘模型來開展研究，此次試驗選用幼齡小鼠造模，建立幼齡小鼠哮喘緩解期模型。目前哮喘發病機制尚未完全明了，氣道慢性炎癥以及炎癥導致的氣道高反應性和氣道重塑是哮喘的基本病理特征［13-14］。本次實驗肺功能分析結果顯示，模型小鼠氣道阻力顯著高于正常對照組，而固本防哮飲可以降低小鼠氣道RL值，降低模型小鼠的氣道高反應性。模型小鼠的BALF中炎性細胞總數明顯升高，細胞分類計數中以嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和單核細胞比例升高為主，表明哮喘緩解期小鼠氣道炎癥仍然存在，固本防哮飲可以降低模型小鼠BALF中炎性細胞總數，降低中性粒細胞和單核細胞百分率，來減輕氣道慢性炎癥。肺臟病理學觀察表明模型組小鼠氣道壁炎性浸潤并存在明顯增生，而固本防哮飲可以顯著減輕肺臟支氣管壁周圍炎性浸潤和氣道壁增生、增厚，改善氣道重塑。

表3　固本防哮飲對幼齡哮喘緩解期小鼠肺組織中IKKβ、IκBα、NF-κBp 6 5（C 2 2 B 4）相對光密度值的影響（±s，n=5）

表3　固本防哮飲對幼齡哮喘緩解期小鼠肺組織中IKKβ、IκBα、NF-κBp 6 5（C 2 2 B 4）相對光密度值的影響（±s，n=5）

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　劑量/（g·kg-1）　IKKβ/GAPDH　IκBα/GAPDH　NF-κB P65（C22B4）/GAPDH正常對照組模型組固本防哮飲低劑量組固本防哮飲中劑量組固本防哮飲高劑量組—1.494±0.110*　2.783±0.267**　1.861±0.560*2.714±0.470　1.350±0.380　2.945±0.154 6.5　2.028±0.153　1.942±0.484　2.478±0.190*13　1.610±0.019*　2.043±0.106*　1.704±0.191**26　1.560±0.454*　2.909±0.724*　1.502±0.228 —**

表4　固本防哮飲對幼齡哮喘緩解期小鼠外周血單個核細胞中I KKβ、IκBα、NF-κB p 6 5（C 2 2 B 4）相對光密度值的影響（±s，n=5）

表4　固本防哮飲對幼齡哮喘緩解期小鼠外周血單個核細胞中I KKβ、IκBα、NF-κB p 6 5（C 2 2 B 4）相對光密度值的影響（±s，n=5）

注:與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　劑量/（g·kg-1）　IKKβ/GAPDH　IκBα/GAPDH　NF-κB P65/GAPDH正常對照組模型組固本防哮飲低劑量組固本防哮飲中劑量組固本防哮飲高劑量組0.509±0.035**　1.070±0.107*　0.423±0.114**—1.123±0.067　0.603±0.186　1.242±0.270 6.5　0.807±0.073**　0.706±0.103　1.001±0.248 13　0.733±0.084**　0.890±0.271　0.758±0.125*26　0.626±0.036**　1.113±0.163*　0.533±0.154 —*

NF-κB通路在控制宿主免疫、炎癥反應和調控細胞增殖、生存的基因表達中發揮重要作用，是已知最重要、最萬能的信號網代表之一。在哺乳動物中，NF-κB家族包含五個相應成員: Re1（也稱為c-Re1）、Re1A（也稱為P65）、Re1B、P50（編碼的NF-κB1基因）和P52（編碼的NF-κB2基因）。這些蛋白相互作用形成具有轉錄活性的二聚體或異質二聚體家族。這五個蛋白都有Re1同源域（RHD），在二聚作用和DNA捆綁中發揮作用。RHD羧基端有一個核定位序列（NLS），轉錄激活功能就是由NF-κB蛋白羧基端露出RHD介導的［15］。

IκB能夠控制NF-κB信號途徑。目前發現IκBs家族有9個成員: IκBα、IκBβ、IκBε、IκBζ、bc1-3、IκBNS、P100、P105和新近發現的IκBη。不同IκB蛋白與不同的NF-κB亞基結合，發揮不同的生理功能［15-17］。IκBα主要介導NF-κB的基礎抑制，是IκB家族中降解速度最快，抑制NF-κB活性的最重要成分［18-19］。靜息細胞的細胞質中NF-κB（通常是P65與P50異質二聚體）與IκBα組成復合體。NF-κB與IκB在細胞中的平衡狀態會被細胞外的快速特異性的信號打破。IκBs有一個錨蛋白重復序列域（ARD），是由6到7個錨蛋白重復序列組成的，能夠捆綁到P65的RHD，掩蓋NLS。NF-κB激活有兩方面:通過蛋白媒體的信號依賴的磷酸化和泛素依賴的IκBα降解及降解后的以細胞核為靶目標的NF-κB P65 NLS釋放。除了IκBα介導的NF-κB同源DNA位點的剝奪，這個過程的許多方面依賴于所有涉及蛋白的折疊狀態的改變來改變轉錄。經典IκB家族，像IκBα典型蛋白，通過掩蓋NF-κBNLS，使他們的轉錄因子在細胞質中被隔絕，從而抑制NF-κB與DNA的結合。NLS可接近性受IκBα降解控制，一旦NLS可接近，NF-κB轉錄因子進入細胞核與DNA結合，發揮調控他們各自靶基因的轉錄的作用［15，19］。

IKK復合體是NF-κB活化作用的信號整合中心，由兩個絲氨酸-蘇氨酸激酶（IKKαand IKKβ）和調節亞單位NEMO（又稱為IKKγ）組成。IKK復合體整合來自所有NF-κB活化刺激信號，并催化各種各樣的IκB和NF-κB蛋白的磷酸化［20］。盡管IKKα和IKKβ在結構和生化方面有相似之處，但是他們有不同的亞細胞位點和磷酸化靶點，因而表現不同的生理病理學作用。IKKβ主要存在于細胞質，IKKα在細胞質和細胞核之間穿梭［21］。IKKβ的作用靶點是IκB兩個鄰近絲氨酸殘基，導致IκB的泛素化和蛋白降解，隨后釋放和激活NF-κB。炎癥因子IL-1、TNFα、內毒素（脂多糖）、病毒感染、雙鏈RNA以及物理信號如紫外線輻射等刺激會導致IKKβ活化和隨后的NF-κB信號途徑的激活［22-23］。

實驗中我們采用肺組織和外周血兩方面來研究哮喘和藥物對IKK/IκB/NF-κB信號通路所產生的影響，分別反映哮喘及固本防哮飲對機體局部和整體免疫功能的作用。在幼齡哮喘緩解期小鼠肺組織中IκBα表達顯著降低（P＜0.01），IKKβ、NF-κB P65（C22B4）表達均明顯增高（P＜0.05），固本防哮飲能夠增加IκBα表達量，降低IKKβ、NF-κB P65 （C22B4）的表達，尤其是中高劑量組作用顯著（P＜0.05，P＜0.01）。在外周血單個核細胞中，IκBα表達也顯著降低（P＜0.05），IKKβ、NF-κB P65（C22B4）表達均明顯增高（P＜0.01），固本防哮飲高劑量組能顯著增加IκBα表達量（P＜0.05），而固本防哮飲各劑量組均能顯著降低IKKβ的表達（P＜0.01）；中高劑量組能顯著降低NF-κB P65 （C22B4）的表達（P＜0.05）。提示幼齡哮喘緩解期小鼠模型中存在IKK/IκB/NF-κB信號通路功能異常，中藥效方固本防哮飲治療哮喘可能的機制是通過調控IKK/IκB/NF-κB信號通路來實現的，即增加IκBα的表達，并抑制IKK、NF-κB的表達和轉錄來發揮其抗炎和調節免疫的作用。

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中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0409-06

作者簡介:袁雪晶（1976—），女，副教授，副主任醫師，博士，主要從事兒童呼吸系統和免疫相關性疾病的研究。Te1: 13913893416，E-mai1: yuanxuejing2007@126.combook=410,ebook=188外周血單個核細胞中IκBα表達量（P＜0.01，P＜0.05），降低肺組織和外周血單個核細胞中IKKβ（P＜0.05，P＜0.01）、NF-κB P65（P＜0.01，P＜0.05）的高表達。結論 固本防哮飲降低氣道高反應性，減輕支氣管炎性細胞浸潤以及調節機體IKK/IκB/NF-κB信號通路的功能失調可能是其防止哮喘復發的作用機制。

基金項目:國家自然科學基金-青年基金（81102615）；江蘇省科技廳-自然基金項目（BK2011868）；康緣中醫藥科技創新基金項目（HZ1008KY）

收稿日期:2014-09-25