西洋參莖葉皂苷保護大鼠腦缺血再灌注損傷的作用

劉 松， 金梅香， 譚興文

（吉林省人民醫院神經內科，吉林長春130000）

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西洋參莖葉皂苷保護大鼠腦缺血再灌注損傷的作用

劉 松， 金梅香， 譚興文

（吉林省人民醫院神經內科，吉林長春130000）

摘要:目的 探討西洋參莖葉皂苷（PQS）預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及可能機制。方法 大鼠分別灌胃給予200 mg/（kg·d）和100 mg/（kg·d）PQS，15 d后，采用Longa改良法建立大鼠腦缺血再灌注模型；計算PQS對大鼠神經功能評分及腦梗死面積比的影響，檢測PQS對血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-10（IL-10）水平的影響，評價PQS對腦組織谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含有量的影響。結果 PQS可以降低大鼠神經功能評分及腦組織梗塞面積比（P＜0.05或P＜0.01）；PQS也可以降低血清中TNF-α水平，升高IL-10水平（P＜0.01）；同時，PQS能夠升高腦組織中GSH-Px和SOD活性，降低MDA含有量（P＜0.01）。結論 PQS預處理能夠有效的減弱腦缺血再灌注導致的損傷，該作用與抑制腦缺血再灌注引起的炎癥反應及氧化損傷有關。

關鍵詞:西洋參莖葉皂苷；缺血再灌注；腦；預處理

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.040

腦血管疾病是導致人類死亡的三大病因之一，其中局灶性腦缺血在各類腦血管疾病中最為常見，具有發病率高、致殘率高、死亡率高的特點［1］。治療腦缺血性損傷的首要原則是盡早恢復血液再灌注。而研究發現，腦缺血后的血流恢復可引起腦組織及功能受損，即腦缺血再灌注損傷［2］。因此，預防和治療腦缺血再灌注損傷已成為防治缺血性腦血管疾病的關鍵。PQS是西洋參中的主要活性成分，具有增強免疫力、抗腫瘤及抗心肌缺血再灌注損傷等作用，但對腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究較少［3］。本研究擬通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察PQS對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，并初步探討其作用機制，為PQS應用于防治缺血性腦血管疾病提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，雄性，體質量（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京2012-0001）。

1.2 藥品和試劑 PQS購于吉林省集安益盛藥業股份有限公司，純度為93％，批號130524；尼莫地平（德國拜耳公司，30 mg/片，批號130522）；TNF-α和IL-10檢測試劑盒購自美國R&D公司；GSH-Px、SOD和MDA檢測試劑盒采用南京建成生物工程研究所產品；其余試劑為國產分析純。

1.3 儀器 RM6240型生理記錄儀（成都儀器廠）；顯微手術器械（浙江寧波醫用縫針廠）；UNICO LTV 2000型紫外分光光度計（尤尼柯中國儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組、給藥及模型建立 雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組（15 mg/kg）、PQS低劑量組（100 mg/kg）和PQS高劑量組（200 mg/kg），每組8只。PQS給藥組連續灌胃給藥15 d，1次/d。假手術組與模型組灌胃給予相同體積的生理鹽水。

采用Longa改良法［4］建立大鼠腦缺血再灌注模型，灌胃給藥15 d后，將麻醉好的大鼠仰臥固定，頸部切口，鈍性分離并暴露右側頸總動脈，在結扎上端距頸總動脈分叉5 mm處剪一小口，插入一尖端光滑、長50 mm、直徑0.23 mm，并在22 mm處作標記的尼龍漁線，當感到有輕微阻力并到達標記處時，扎緊并固定尼龍漁線；結扎2 h后，拔出尼龍漁線15 mm進行再灌注；假手術組不插線，其余步驟同上，術中應保持大鼠肛溫37～38℃。

2.2 神經功能評分 參照Bederon 4分制評分方法［5］，在實驗結束后，對模型大鼠神經功能進行評分。無神經系統損傷癥狀者記為“0”分；不能完全伸展對側前爪者記為“1”分；不轉圈、伴有前爪屈曲對側壓有抵抗者記為“2”分；向左側轉圈、伴有前爪屈曲對側壓有抵抗者記為“3”分；行走時無自發活動或死亡記為“4”分。

2.3 腦梗塞面積比的計算 斷頭處死大鼠，將大腦完整取出后，冰凍5 min；經連續2 mm冠狀切片后，在2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，2％）溶液中染色，37℃恒溫孵育30 min，用多聚甲醛（4％）固定24 h。經TTC染色后，用美國NIH公司的Image J 1.41圖像分析軟件分別檢測著色部分和非著色部分面積，計算腦梗塞面積比。

2.4 血清中TNF-α和IL-10水平檢測 實驗結束后，頸總動脈取血4 mL，加肝素，1 500 r/min離心10 min，收集血清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）法測定TNF-α和IL-10含有量，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.5 腦組織中GSH-Px、SOD活性和MDA含有量檢測 實驗結束后，斷頭取腦，取缺血再灌注側大腦，用濾紙吸去殘血，取0.2 g腦組織，剪碎后，冰水浴下加入細胞裂解液，高速勻漿，提取腦組織總蛋白，靜置、離心后取上清，采用化學比色法測定腦組織中GSH-Px、SOD活性和MDA含有量。

3 結果

3.1 PQS對大鼠神經功能評分及腦梗塞面積比的影響 尼莫地平組及PQS高、低劑量組與模型組比較，均能顯著降低Bederon評分值，改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能障礙（P＜0.01）。大鼠大腦中動脈缺血24 h再灌注2 h后有明顯的腦梗塞發生，而尼莫地平組及PQS高、低劑量組均可明顯降低缺血再灌注后的腦梗塞面積比，與模型組比較，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

表1　PQS對大鼠神經功能評分及腦梗塞面積比的影響（x ±s，n=8）

3.2 PQS對大鼠血清TNF-α和IL-10水平的影響 尼莫地平組及高、低劑量PQS組均能使缺血再灌注損傷大鼠血清中TNF-α水平下降，與模型組比較，具有顯著性差異（P＜0.01）；而與模型組比較，尼莫地平組及高、低劑量PQS組明顯升高缺血再灌注損傷大鼠血清中IL-10水平（P＜0.01）。結果見表2。

表2　PQS對大鼠大鼠血清TNF-α和I L-1 0水平的影響（±s，n=8）

表2　PQS對大鼠大鼠血清TNF-α和I L-1 0水平的影響（±s，n=8）

注:與假手術組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　劑量/ （mg·kg-1）TNF-α/ （ng·L-1）IL-10/ （ng·L-1）假手術組　　—　7.43±1.43　 263.14±13.39模型組　　—　17.75±2.03##　126.29±13.62##尼莫地平組　15　8.14±1.25**　240.17±16.24**PQS高劑量組　200　9.27±1.38**　217.41±17.45**PQS低劑量組　100　 11.64±1.32**　172.77±20.82**

3.3 PQS對大鼠腦組織中GSH-Px、SOD活性和MDA含有量的影響 尼莫地平組及高、低劑量PQS組均能使缺血再灌注損傷大鼠腦組織GSH-Px和SOD活性升高，與模型組比較，具有顯著性差異（P＜0.01）；而與模型組比較，尼莫地平組及高、低劑量PQS組明顯降低缺血再灌注損傷大鼠腦組織MDA含有量（P＜0.01）。結果見表3。

表3　PQS對大鼠腦組織GSH-Px、S 0 D活性和MDA含有量的影響（±s，n=8）

表3　PQS對大鼠腦組織GSH-Px、S 0 D活性和MDA含有量的影響（±s，n=8）

注:與假手術組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　劑量/（mg·kg-1）　GSH-Px/（U·mg Prot-1）　SOD/（U·mg Prot-1）　MDA/（nmo1·mg Prot-1）假手術組　　—　92.11±6.05　134.78±15.29　5.63±0.96模型組　　—　56.29±7.14##　98.64±12.52##　11.65±1.54##尼莫地平組　15　86.37±6.84**　130.32±14.86**　6.24±0.82**PQS高劑量組　200　81.42±6.57**　124.38±13.33**　6.85±0.86**PQS低劑量組　100　70.13±7.45**　115.17±11.71**　7.16±1.21**

4 討論

采用線栓法構建局灶性腦缺血再灌注模型，可以很好的模擬人類大腦中動脈阻塞腦卒中的病理過程，該模型由Koizumi首創，并經Longa改良，具有成功率高、操作簡單、結果穩定、術后感染少等優點，目前已成為缺血性腦血管病研究中最為常用的經典模型之一［6］。神經功能缺陷評分是建模成功的標志，同時也是反映藥物對腦缺血再灌注損傷保護作用的重要指標［7］。本實驗采用Bederon 4分制評分方法考察了PQS對腦缺血再灌注大鼠神經功能損害的影響，結果證實，PQS高、低劑量組與模型組比較，均能顯著降低Bederon評分值，改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能障礙（P＜0.01）。腦梗死面積比是評價腦缺血再灌注損傷最常用的客觀指標。TTC染色法是目前國內外學者普遍采用的檢測腦缺血再灌注損傷梗死區域的方法［8］。將大鼠腦組織切片放入TTC溶液中，TTC溶液可以使腦梗死灶不染色，呈現蒼白色，而正常組織染為紅色。本實驗結果顯示，PQS高、低劑量組可明顯降低缺血再灌注后的腦組織梗塞面積比，與模型組比較，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。PQS具有益氣養心及和血的功效，在臨床上主要用于冠心病、心絞痛等疾病的治療［9-10］。而本研究的結果證實了PQS預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，此結果將為PQS用于缺血性腦血管疾病的防治提供一定的實驗依據。

炎癥反應是造成腦缺血再灌注損傷的重要原因之一，多種細胞因子和炎癥細胞均參與了炎癥反應。研究表明［11］，當腦缺血再灌注損傷發生后數小時內，炎癥因子表達顯著增加，引起腦組織損傷，進而導致氧自由基產生、血管舒縮性改變、細胞毒性酶釋放和微血管閉塞等。在腦缺血再灌注損傷中，TNF-α和IL-10等炎癥因子的表達量可以直接反應炎癥反應的發生水平［12］。本研究結果發現，PQS可以降低腦缺血再灌注模型大鼠血清中TNF-α水平，升高IL-10水平（P＜0.01），此結果表明PQS可以抑制炎癥反應的發生。氧化損傷也是目前公認的腦缺血再灌損傷的重要機制之一，缺血可以使ATP匱乏，引起線粒體功能下降，使電子傳遞鏈受損，導致活性氧產生增加。GSHPx、SOD活性及MDA含有量與活性氧的產生密切相關，可以反映缺血組織氧化損傷程度［13］。本研究證實，PQS能夠提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中GSH-Px和SOD活性，降低MDA含有量，表明PQS可以在一定程度上起到抗氧化損傷的作用。

總之，通過以上研究結果表明，PQS預處理能夠有效的減弱腦缺血再灌注引起的損傷，該作用與抑制腦缺血再灌注引起的炎癥反應及氧化損傷有關。

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作者簡介:劉 松（1981—），男，主治醫師，從事腦血管病的診斷與治療研究。Te1:（0431）85595280，E-mai1: 1iusongcc@126.com

收稿日期:2014-12-21

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0418-04