雷公藤制劑抑制小鼠耳腫脹譜效關系研究

劉雪梅， 林 兵， 劉志宏， 楊麗娜， 池 婕， 宋洪濤*

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350108；2.南京軍區福州總醫院藥學科，福建福州350025）

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雷公藤制劑抑制小鼠耳腫脹譜效關系研究

劉雪梅1，2， 林 兵2， 劉志宏2， 楊麗娜2， 池 婕2， 宋洪濤2*

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350108；2.南京軍區福州總醫院藥學科，福建福州350025）

摘要:目的 考察不同廠家雷公藤多苷片指紋圖譜及抗炎藥效，并分析指紋圖譜與抗炎藥效的關聯性。方法 采用高效液相色譜法（HPLC）建立7個廠家雷公藤多苷片指紋圖譜，得到11個共有峰；選擇二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型進行抗炎藥效學研究；采用灰色關聯度分析法研究11個共有峰與其抗炎藥效的相關性。結果 各廠家雷公藤多苷片指紋峰數目和大小差異較大且均有抗炎作用；構建了雷公藤多苷片“譜-效”模型，各共有峰與抗炎藥效的關聯度均大于0.5，其中9號峰和6號峰對藥效的貢獻較大（關聯度均大于0.77），各峰所代表的化學成分對其抗炎作用貢獻的大小順序為: 9＞6＞3＞5＞1 =10＞4＞8＞2 =11＞7。結論 不同廠家雷公藤制劑指紋圖譜不同，抗炎藥效亦不同，其是共有峰所代表的化學成分群綜合作用的結果，將兩者進行關聯度分析結果顯示，各峰與藥效的關聯度不等，對藥效的貢獻強弱不同。

關鍵詞:雷公藤；雷公藤多苷片；HPLC；抗炎；譜效關系；灰色關聯度法

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.042

雷公藤是衛矛科雷公藤屬植物雷公藤TriPterygium Wilfordii Hook.f.的干燥根。主要含有二萜類、三萜類、生物堿類等成分，具有顯著的抗炎、免疫抑制藥理活性［1］。目前，已經上市的雷公藤制劑有雷公藤多苷片、雷公藤片和雷公藤總萜片等，臨床上多用于類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、腎病綜合癥等自身免疫疾病，療效顯著。但其毒性較大，不良反應高發，總不良反應發生率為58.1％，嚴重程度通常是患者不能耐受的［2］，從而嚴重影響了其臨床應用。究其原因，雷公藤制劑中有些成分既是藥效成分又是毒性成分，治療窗口窄，質量控制方法不完善［3］。本研究建立了雷公藤多苷片的指紋圖譜，開展雷公藤制劑譜效關系研究，為深入研究雷公藤藥效物質基礎及建立較完善的質量控制方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 1200型快速高效液相色譜儀、XDB-CN色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美國Agi1ent公司）；KQ-800KDE型超聲波清洗器（上海超聲波儀器有限公司）；YO-202型電子天平（上海精密儀器科學有限公司）；SePPak中性氧化鋁柱（6 cc/1 g，美國Waters公司）；UV-2501型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；6 mm直徑打孔器（溫州新星五金工具廠）。

1.2 試劑 乙腈、甲醇（色譜純，美國Sigma公司）；乙酸乙酯、二甲苯（分析純，上海聯試化工試劑有限公司）；阿司匹林腸溶片（批號BJ14634拜耳醫藥保健有限公司）；雷公藤甲素（批號111567-200502，純度≥99％，南京澤朗醫藥科技有限公司）；雷公藤內酯酮（純度≥98％，南京澤朗醫藥科技有限公司）；雷公藤次堿（純度≥98％，批號131229，南京景竹生物科技有限公司）；雷公藤多苷片購買自A（批號120905）、B（批號120917）、C（批號20120802）、D（批號20120901）、E（批號120502）、F（批號121202）、G（批號120601）7個廠家。

1.3 動物 清潔級KM小鼠，雄性，90只，體質量18～22 g，由南京軍區福州總醫院比較醫學科提供，合格證號SCXK（滬）2012-0002。

2 方法與結果

2.1 供試品及樣品的制備

2.1.1 供試品的制備 取雷公藤多苷片適量，研磨，精密稱取0.2 g，加乙酸乙酯30 mL，超聲提取10 min，放冷，過濾，取15 mL濾液用中性氧化鋁柱純化，收集流出液，再用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，合并流出液和洗脫液，吹干，殘渣用2 mL甲醇溶解，過0.22 μm濾膜，即得指紋圖譜所需的供試品。

2.1.2 樣品的制備 雷公藤多苷片按照“2.1.1”項供試品前處理的方法得到吹干后樣品，加吐溫-80水浴加熱（60℃）溶解，再用生理鹽水（0.9 ％ Nac1溶液）稀釋成6 mg/kg的溶液用于藥效試驗。

2.1.3 對照品的制備 取雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷公藤次堿適量于10 mL量瓶中，加乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，制得對照品溶液。

2.2 雷公藤多苷片指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 Agi1ent XDB-CN色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）。流動相:乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 min，25％～32％ A；15～35 min，32％～42％ A；35～56 min，42％～82％ A）；檢測波長218 nm；柱溫30℃。體積流量: 1.0 mL/min。進樣量10 μL，記錄56 min色譜圖。

2.2.2 方法學考察 經方法學考察，共有色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的精密度、穩定性和重復性均符合要求，RSD均小于5％。

2.2.3 HPLC指紋圖譜及共有峰的建立 分別精密吸取雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷公藤次堿和供試品溶液照“2.2.1”項色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，結果見圖1和圖2。選定11號峰為對照峰，采用國家藥典委員會編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”相似度軟件，對7個廠家（A～G表示）雷公藤供試品的HPLC指紋圖譜進行處理，得到對照指紋圖譜，結果見圖3。

1.雷公藤甲素 3.雷公藤內酯酮 11.雷公藤次堿圖1　雷公藤對照品的HP L C圖

圖2　各廠家雷公藤多苷片樣品H P L C圖

圖3　雷公藤多苷片對照指紋圖譜

2.3 抗炎藥效研究

2.3.1 實驗方法 選取雄性小鼠（18～22 g）90只，隨機分為9組，每組10只?？瞻讓φ战M給予生理鹽水，陽性對照組給予阿司匹林腸溶片，試驗組給予7個廠家的樣品。阿司匹林腸溶片與樣品分別按0.4 g/kg和6 mg/kg的劑量灌胃給藥，1次/d，連續給藥4 d。末次給藥45 min后，于小鼠右耳兩面涂二甲苯30 μL［4］。15 min后將左、右兩耳片切下，以6 mm打孔器取下左、右耳片，立即用電子天平稱重（mg），按下式計算耳腫脹度。

腫脹度=右耳質量-左耳質量

2.3.2 實驗結果 結果顯示，實驗組A～G與陰性對照組比較，7個廠家雷公藤樣品對小鼠耳腫脹均有顯著抑制作用，且作用不等，其中A～E廠家的P＜0.01，F和G兩個廠家的P＜0.05。原因可能是各廠家原料藥的來源、提取純化工藝、質量控制方法不同，使得制劑中成分和含有量不同，使得藥效產生差異。結果見表1。

表1　抗炎活性實驗結果（n=1 0，±s）

表1　抗炎活性實驗結果（n=1 0，±s）

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　腫脹度/mg陰性對照組　9.8±1.7陽性對照組　2.5±1.2**A 3.3±1.1**B 4.2±1.4**C 5.0±1.3**D 6.0±1.2**E 6.2±1.2**F 7.6±1.3*G 7.2±1.5*

2.4 抗炎譜效關系的建立

2.4.1 共有峰峰面積與關聯度 采用“灰色系統理論建模軟件（GTMS3.0）”，中的灰色關聯分析。以各共有峰峰面積和抗炎藥效數據為序列，分別計算藥效與峰面積序列的關聯度，用以分析指紋圖譜各色譜峰與抗炎藥效的相關性，結果見表2。

2.4.2 譜效關系的關聯度分析 由結果可知，指紋圖譜中各個色譜峰所代表的化學成分與抗炎作用具有一定的關聯（關聯度均大于0.53），表明雷公藤多苷片的抗炎作用是其化學成分群共同作用的結果。依據關聯度的大小，各成分對抗炎作用貢獻大小的順序為9＞6＞3＞5＞1，10＞4＞8＞2，11＞7，其中1號峰為雷公藤甲素，3號峰為雷公藤內酯酮，11號峰為雷公藤次堿。9和6號峰的關聯度均大于0.77，表明其所代表的化學成分與抗炎作用的關聯性較大。

3 討論

雷公藤制劑化學成分多，結構復雜，分析起來難度較大。在試驗的過程中以指紋峰數目和分離度為指標分別對色譜柱、洗脫程序、檢測波長、流動相、柱溫等色譜條件進行了優化，將不同廠家的雷公藤制劑供試品溶液應用梯度洗脫，使得其中的化學成分得以分離。

表2　不同樣品共有峰峰面積與關聯度

對流動相系統進行選擇時，由于甲醇在203 nm下有較大吸收，而雷公藤制劑中大多數有效成分均存在末端吸收，因此選擇乙腈作為流動相，對乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.1％冰醋酸、乙腈-0.1％磷酸-0.2％三乙胺［5-8］系統進行選擇，發現乙腈-水系統作為流動相分離效果最好，并對幾種不同固相萃取方法:中性氧化鋁柱、硅膠柱、MAX柱、HLB柱以及基質分散固相萃取方法進行比較。結果發現，中性氧化鋁柱能較好的將有效成分保留且能使指紋峰的分離度達到要求；因此選擇中性氧化鋁柱進行萃取。

抗炎藥效研究選擇的是二甲苯致小鼠耳腫脹模型，經過預試驗選擇了藥效較好的劑量6 mg/kg，選擇該劑量考察各廠家雷公藤制劑對耳腫脹的影響。結果顯示，不同廠家雷公藤制劑樣品均有抑制小鼠耳腫脹的作用且作用強度不同。

目前中藥譜效關系學主要應用于單味藥材的質量評價和中藥復方的藥效物質基礎這兩方面［9］。用于譜效分析的方法有相關分析、聚類分析、灰色關聯度分析、回歸分析、主成分分析等［10］?；疑P聯度分析來自灰色系統理論，基本思想是一種相對性的排序分析，根據序列曲線幾何形狀的相似程度來判斷其聯系是否緊密。如果一組幾何曲線形狀越相似，則關聯度越大，反之則越小，由此從所考察的復雜系統中找出主次因素，為系統綜合決策及提高綜合效益提供信息。也就是說兩者在發展過程中相對變化基本一致，則認為兩者關聯度大，反之，兩者關聯度小［11］。

本研究采用灰色關聯度分析法對指紋圖譜共有峰峰面積和藥效數據分析，結果表明指紋圖譜中11個共有峰所代表的化學成分與抗炎藥效的關聯度均大于0.5，說明這11個峰均與藥效有關，證明雷公藤的藥效是多成分共同起效的結果。其中6和9號峰的關聯度大于平均關聯度（0.59），是11個共有成分中的主要藥效組分。再比較各個峰的變異系數（CV％），發現除了11號峰變異系數較?。?.8％）外，不同廠家雷公藤制劑其它峰變異較大，提示不同廠家雷公藤制劑主要藥效組分的差異可能是造成藥效（腫脹度）差異的主要原因。

本研究采用灰色關聯度分析法建立了雷公藤制劑的指紋圖譜與其抗炎藥效的譜效關系，明確了指紋圖譜代表的化學成分與抗炎作用關聯的大小，后續的研究將對11個共有峰進行質譜的分析，表征具體抗炎作用的物質成分，為進一步對其它藥效物質基礎的深入研究和雷公藤的質量控制提供借鑒。

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*通信作者:宋洪濤（1968—），男，博士，主任藥師，博士生導師，研究方向為藥劑學和臨床藥學。Te1:（0591）22859459，E-mai1: sohoto@viP.163.com

作者簡介:劉雪梅（1987—），女，碩士生，從事藥物新劑型與制劑新技術。Te1:（0591）22859972，E-mai1: 496294479@qq.com

基金項目:福建省科技計劃重大項目（2012I1001）

收稿日期:2014-12-24

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0425-03