食源性致病菌的紙芯片檢測方法研究進展

邴欣，劉靜靜，張震，劉兆臣，華京君，*

（1.山東省產品質量檢驗研究院，山東濟南250012；2.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014）

食源性致病菌的紙芯片檢測方法研究進展

邴欣1，劉靜靜2，張震2，劉兆臣2，華京君1，*

（1.山東省產品質量檢驗研究院，山東濟南250012；2.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014）

紙芯片檢測方法是一種成本低、可回收且易操作的檢測方法。近年來微流控紙芯片技術在臨床診斷、環境監控以及食品安全分析等方面都有著廣闊的應用。本文介紹了食源性致病菌的紙芯片檢測方法，討論了紙芯片技術的應用進展以及開發前景。

紙芯片；食源性致病菌；檢測；應用進展

食源性致病菌是危害食品安全和人類健康的主要因素，其引起的食品安全問題一直受到公眾的廣泛關注。為有效監控食品安全，建立便攜、快速、有效的檢測技術十分必要。傳統食源性致病菌的檢測技術存在耗時長、效率低、設備復雜等問題。紙芯片技術作為一種新型的紙上分析技術平臺，其具有高效、便攜、制作簡單、操作方便、耗樣量少等優點，引起了廣泛關注并在多個領域得到應用。紙芯片檢測不但可以實現對樣品中多組分目標物的定量檢測，而且可以實現對食品、環境中多種污染物的快速分析。本文介紹了紙芯片技術的優點及食源性致病菌的紙芯片檢測方法，討論了紙芯片檢測的發展前景。

1 食源性致病菌的種類和危害

通過食物傳播疾病的細菌有很多種，常見的革蘭陰性菌有沙門菌屬、志賀菌屬、大腸桿菌等，常見的革蘭陽性菌有芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、李斯特菌屬等。大多數腸道菌屬于革蘭氏陰性菌。

沙門氏菌是引起人類腸道疾病的主要食源性致病菌[1]。許多人感染沙門氏菌主要是食用了受污染的豬肉和豬肉產品[2]，它主要污染肉、蛋、奶等畜產品，能夠引起腸傷寒、腸胃炎以及敗血癥等疾病，重者甚至危及生命。

志賀菌屬是導致發展中國家和醫療衛生條件較差的地區幼兒腹瀉疾病爆發的主要食源性致病菌之一，通過入侵和破壞結腸上皮細胞引發急性炎癥[3]。由受到志賀氏菌污染的食品和水源引起的腹瀉、痢疾等疾病的報道時有發生，超過一半的病例為5歲以下的兒童[4]。

大腸桿菌又稱大腸埃希氏菌（Escherichia coli），其中有少數血清型可引起食源性疾病，對人類生命健康產生很大危害[5]。產腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichiacoli，ETEC）可以導致人類和初生幼畜腹瀉[6]，致病性大腸桿菌通過污染飲水、食品引起疾病，部分患者會發展為溶血性尿毒綜合征，發生率最高的的年齡階段為5歲～9歲[7]，病情嚴重者可危急生命。

2 食源性致病菌的檢測方法

食源性致病菌快速檢測方法主要有酶聯免疫吸附分析法、免疫層析技術、ATP發光檢測方法、傳感器檢測技術、PCR技術等[8-9]。

2.1 酶聯免疫吸附分析法

酶聯免疫吸附分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是將抗原抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合發展建立的一種免疫分析方法[10]。是將特異性的抗體（抗原）包被在固體基質上，加入待測樣品和酶標抗原（抗體），洗滌除去未結合物質，加入與酶反應的底物，底物經過酶的催化后呈現不同深淺的顏色，肉眼觀察顏色深淺對待測樣品進行定性測定。待測物的量與有色產物的量成正比，可借吸光度值進行定量檢測[11]。

各種研究表明，ELISA對儀器設備要求不高，測定成本低，方法快速、簡便，試劑保存時間較長，自動化程度高，無放射性同位素污染[12]。但該方法依然存在著諸多不足：無法進行多殘留分析，對試劑的選擇性高，對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應，結果易出現假陽性等[13]。

2.2 免疫層析技術

免疫層析法（immunochromatography）是以硝酸纖維素膜為固相載體，通過毛細管作用使含金標記的抗原或抗體與特異性配體的反應在膜上進行，通過可目測的標記物而得到呈色的陽性信號，而游離標記物通過層析作用越過檢帶，與結合標記物自動分離[14]。隨著免疫層析法的不斷發展，標記材料和檢測儀器多樣化，檢測結果從肉眼判定的半定量檢測到現在儀器直接讀數的定量測，靈敏度大大提高[15]。免疫層析技術具有簡便、快速等特點，但依然存在著諸多不足：結果判定易受環境、觀察時間等因素影響；檢測存在交叉反應；易出現假陽性和假陰性反應，成本較高，多數產品不能定量等[16]。

2.3 ATP發光檢測方法

細菌中的ATP含量與細菌數呈正相關，可通過生物熒光法檢測細菌中ATP含量，間接獲得細菌總數。研制了一種便攜式生物熒光傳感器，可依次進行細菌ATP的提取和檢測，最終實現對細菌總數的快速檢測。ATP發光檢測技術具有快速經濟、操作簡單、易攜帶等特點[17]。但仍然存在諸多問題：檢測過程需要將熒光信號轉換為電信號，轉換過程受外界環境影響；不具有特異性；靈敏度有待提高等[18]。

2.4 生物傳感器檢測技術

生物傳感器是利用生物識別元件的特異性生化反應，借助各種信號轉換元件對生化物質進行檢測的一類裝置，根據其感受器和換能器的不同分為多種生物傳感器[19]。與傳統檢測方法相比，具有選擇性強、精確度高、檢測時間短等優勢[20]，但仍然需要解決一些問題，如捕獲效率低、電極穩定性差、重復性差等[21]。

傳統方法檢測食源性致病菌用量多、耗時長、檢測設備復雜，多數方法只能對一種致病菌進行定性檢測，因此，微流控紙芯片技術作為一種高效、耗樣量少、便攜、制作簡單、操作方便的檢測方法引起廣泛關注。

3 微流控紙芯片的原理、優勢、應用范圍

微流控芯片技術（Microfluidic chip）是將生物或化學樣品制備、輸送、反應、分離、檢測等基本操作集成到一塊芯片上完成[22-23]。微流控芯片制作的材料一般采用硅片、玻璃、石英及多種有機聚合物材料，芯片的加工技術有光刻法、蝕刻法、熱壓法、模塑法等。其中光刻工藝是最基礎的，并已被廣泛應用于制作微流控裝置。但是，此過程費時費力且成本較高[24]。

紙芯片是近幾年發展起來的一種基于紙的微流控器件，它具有成本低廉、操作簡單、不需要外援設備、可多元檢測等優點，因而有望成為最廉價的分析檢測器件[25]。同時，紙具有綠色環保，可回收，可降解等性質，對于大多數設備只需0.1 μL～1 μL待測樣品足以飽和用于檢測。這種平臺有很大的潛力，提供接近“零成本”診斷[26]。紙通常是白色的，可以作為色度測試一個很好的媒介[27]。待測溶液在μPADs上可通過毛細管作用移動，無需外力，通過化學改性的μPADs表面可以對待測物進行簡單快速的比色分析，也可與其它裝置結合進行定量檢測。

由于硝酸纖維素膜的平均孔徑非常小且均勻制作過程中的蠟滲透慢得多，并且可以更精確地控制[28]。光刻需要六步而蠟印刷只需要兩個步驟，當紙被加熱時，蠟熔化并垂直和橫向擴散進紙，創造了疏水性屏障。因此，固體蠟打印通道是目前最適合批量生產的[29]。

二維微流控紙芯片是基于親水的通道和疏水的屏障的制作而成，在此基礎上，利用多層濾紙的疊加或折疊等[30]方法制作三維微流控紙芯片。晶體管、發光二極管、基于紙的電池、超級電容器等都是基于紙的裝置[31]。

基于這些優勢，紙芯片設備被廣泛應用于資源有限的環境中，例如緊急情況下、軍事領域的任務、家庭醫療保健等[32]。微流控紙芯片技術被廣泛應用到臨床診斷、環境監控以及食品安全分析等方面[33]。

人類食源性和水源性的疾病通常是攝入了被病原菌污染的食品或飲料。Eden Morales-Narváez等[34]提出了一種紙基側流免疫測定病原體的裝置，結合石墨烯氧化物可致熒光猝滅來檢測大腸桿菌，該裝置在標準緩沖液中的檢測限可達10 CFU/mL，在瓶裝水和牛奶中檢測限為100 CFU/mL。這種低成本的一次性和易于使用的設備有很大應用價值。

環境中農藥的污染已經引起越來越多的關注，時刻提醒我們環境監測的重要性。Shoumei Wang等[35]提出了基于紙的印跡聚合物作為受體的化學發光檢測設備，利用間接競爭法測定2，4-二氯苯氧乙酸農藥，該裝置可以檢測飛摩爾級濃度的2，4-二氯苯氧乙酸農藥。

2009年H1N1流感嚴重影響發展中國家，傳統的診斷方法不適合在資源有限的環境中使用，Natalia M.Rodriguez等[36]開發了一種基于紙芯片的快速檢測方法，直接從臨床病人的鼻咽中提取樣品，經純化、等溫鏈擴增后直接用試紙條檢測，45 min內便可完成，檢測限可達106Copies/mL，效率是傳統檢測方法的10倍。

4 食源性致病菌的紙芯片檢測

傳統生物化學方法檢測食源性致病菌費時費力而且只能用于一種細菌的檢測。Feng Tian等[37]提出了一種基于聚乙二醇與功能化納米多孔氧化鋁膜的微流控紙芯片，可同時檢測樣品中的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，該傳感器的最低檢測限可達102CFU/mL。

Wen-Hsin Chang等[38]將聚合酶鏈反應、納米金探針檢測與微流控紙芯片平臺相結合，不但實現了活細菌的快速檢測，檢測限在102CFU/mL，同時可以區分最低104CFU/mL之間的多種細菌。

W Leineweber等[39]提出一個基于功能化纖維素紙的3-D蠟印微流控裝置檢測細菌。利用互補鏈結合檢測細菌RNA的存在，金納米粒子聚集可見色度變化，將其與電子設備連接可定量檢測細菌RNA的濃度。這種檢測方法可以該裝置可以檢測飛摩爾級RNA濃度。

Yixian Wang等[40]提出了一種基于膠體金和改性的石墨烯紙裝置快速檢測大腸桿菌O157：H7，將金屬納米材料、石墨烯紙和生物識別分子相結合，電化學阻抗譜法檢測大腸桿菌O157：H7。結果表明，該裝置線性范圍寬（1.5×102CFU/mL ～1.5×107CFU/mL），最低檢出限為1.5×102CFU/mL，該裝置的石墨烯紙具有高耐受力。

5 總結與展望

綜上所述，微流控紙芯片檢測裝置作為一種新型的便攜式器件，在過去幾年中得到廣泛的關注與發展，其在食源性致病菌的檢測中取得初步的應用，展現出廣闊的發展前景。

然而，微流控紙芯片用于食源性致病菌的檢測尚處于初期階段，還有很多問題亟待研究改善。今后的研究方向主要包括開發廉價的疏水材料；提高圖案的精度，實現液體的有序操控；隨著電子產品的日益發展，電子分析、遠程網絡與微流控相結合方面有很大發展空間。

相信通過不斷的優化與研究，研制針對食源性致病菌具有富集、分離、檢測多功能于一體的微流控紙芯片，實現其定量分析的設備很快會出現，并將在其它領域有著更深入的應用。

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Research Progress of Paper Chips Detection Method for Food-borne Pathogenic Bacteria

BING Xin1，LIU Jing-jing2，ZHANG Zhen2，LIU Zhao-chen2，HUA Jing-jun1，*
（1.Shandong Product Quality Inspection Research Institute，Jinan 250012，Shandong，China；2.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China）

Paper chips detection method is a testing way that has advantages of low lost，recycle and easy-tohandle.In recent years，microfluidic chip technology had been widely applied in clinical diagnosis，environmental monitoring and food security analysis.This paper introduced paper chips detection method for foodborne pathogenic bacteria and discuss its application process and development prospect.

paper chips；food-borne pathogenic bacteria；detection；application process

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.044

國家質量監督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2014QK122）

邴欣（1977—），男（漢），高級工程師，博士，研究方向：產品質量安全。

*通信作者

2016-04-07