硅膠表面阪崎克羅諾桿菌生物膜的形態觀察

景春娥，李萍，杜欣軍，王碩

（天津科技大學食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457）

硅膠表面阪崎克羅諾桿菌生物膜的形態觀察

景春娥，李萍，杜欣軍，王碩*

（天津科技大學食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457）

阪崎克羅諾桿菌是一種食源性條件致病菌，它能導致嬰幼兒罹患壞死性小腸結腸炎、菌血癥、腦膜炎等疾病。在硅膠表面形成生物膜，可能是導致阪崎克羅諾桿菌感染的重要途徑。使用結晶紫法測定阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在食品級硅膠表面的靜態生物膜成熟曲線，并且采用掃描電子顯微鏡對其在食品級硅膠表面的靜態生物膜的形成過程進行形態學觀察。觀察到阪崎克羅諾桿菌在硅膠表面形成了具有三維結構的成熟生物膜形態。在3 h能粘附到硅膠表面，并且在12h～24h已經形成了比較成熟的生物膜。

阪崎克羅諾桿菌；生物膜；硅膠；粘附；成熟

細菌生物膜是指細菌在生長過程中附著于物體表面而形成的由細菌細胞及其分泌的細胞外多聚物基質等所組成的膜樣多細菌復合體，胞外多聚物主要成分包括多糖基質、纖維蛋白、脂蛋白、胞外DNA等[1]。生物膜能夠增強細菌對外界環境的耐受性[2]。細菌生物膜的形成是一種高度依賴環境信號的動態過程，即由多細胞參與不同階段組成的一個過渡性過程，主要包括粘附、微菌落形成、成熟生物膜以及游離菌的播散與再次定植[2-3]。在食品加工環境中，食品加工器械以及餐飲器具表面的污染是病原菌傳播到食品中的主要原因之一[4]。在生物膜的保護作用下，即使通過消毒液或常規的清洗后，這些菌可能仍然存活[5]，產生持續的交叉污染，不但會降低食品的保質期而且會給消費者帶來很大的危險[6-7]。阪崎克羅諾桿菌具有生存溫度范圍廣[8]、抗滲透壓能力強[9]的特征，并且具有高效的生物膜形成能力[10-12]，這些特征是其在食品加工環節成功傳播并且成為潛在污染源的重要原因。硅膠因其具有化學性質穩定、吸附性能強、熱穩定性好、安全性等特點已被廣泛應用于食品行業，如采用食品級硅膠為原料制成的奶嘴、奶瓶以及食品蛋糕模具等[13]。

阪崎克羅諾桿菌能夠在硅膠表面形成生物膜[8，14]，并且會隨著生物膜的成熟，生物膜微菌落或游離細菌發生播散，交叉污染準備配方奶粉的器具。隨后，這些成功播散的細菌生物膜團塊會隨著食物進入胃，并且保護其免受胃酸的傷害[10-11，15]。因此，這些細菌可能粘附到嬰幼兒的腸上皮細胞，成為易感嬰幼兒的潛在危險因素。已經有研究表明，嬰幼兒配方奶粉的人工喂養與其罹患壞死性結腸炎疾病具有正相關性[16-17]。由于阪崎克羅諾桿菌感染所導致的新生兒壞死性小腸結腸炎，其特征為腸黏膜甚至為腸深層的壞死，本癥是新生兒消化系統極為嚴重的疾病[16，18]，但是，目前對于阪崎克羅諾桿菌在食品級硅膠表面的生物膜形成過程及其形成機制的研究報道很少。

由于阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894是從與新生兒重癥監護室疾病爆發有關的配方奶粉中分離的菌株[19]，也是克羅諾桿菌屬中第一個通過全基因組測序的菌株[20]。本研究利用食品級硅膠材質來研究阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在材料表面靜態生物膜的形成過程，以便模擬研究食品加工環境中阪崎克羅諾桿菌生物膜的形成特點。采用掃描電子顯微鏡對阪崎克羅諾桿菌在食品級硅膠片表面的生物膜的形成過程進行了形態學觀察。因此，對于阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在硅膠表面生物膜形成過程的研究對于防止嬰兒配方奶粉調制過程中的交叉污染的發生具有現實指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株（C.sakazakii ATCC BAA-894）：購自美國菌種保藏中心，是已經測序菌株；細菌粘附材料（食品級硅膠）：東莞市鴻凱橡膠制品有限公司。

1.2 儀器與試劑

SU-1510掃描式電子顯微鏡：購自日本日立公司；96孔細胞培養板與24孔細胞培養板：購自美國Corning公司；結晶紫：購自天津市北方天醫化學試劑廠；LB培養基：購自北京陸橋技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌懸液的制備

平板劃線挑取單菌落于盛有5 mL液體LB培養基的試管中，37℃、150 r/min恒溫振蕩培養12 h得到種子液，4℃，3 000 r/min，離心5 min棄上清，收集菌體沉淀；然后用無菌的PBS緩沖液重懸菌體，4℃，3 000 r/min，離心5 min，重復3次，收集菌體沉淀，用無菌新鮮的液體LB培養基重懸菌液；按照比例，菌液 ∶甘油（4∶1）加入到1.5 mL Eppendorf管中混勻，用封口膜封口，-20℃保存備用。培養均采用以下條件：按1∶100（體積比）的比例將休止細菌懸液接種于液體LB培養基中，于37℃恒溫振蕩培養（150 r/min）過夜；按1%的接種量轉接后同樣條件培養2 h，菌液在600 nm處測OD值，并用無菌新鮮的液體LB培養基將菌液OD值調至0.1，取1.0 mL菌液離心3 000 r/min,5 min，棄上清，加入1mL液體LB培養基用于后續試驗。

1.3.2 阪崎克羅諾桿菌生物膜形成能力測定方法

在96孔細胞培養板上測定阪崎克羅諾桿菌生物膜形成能力，具體方法步驟如下[21-23]：在96孔細胞培養板中分別加入40 μL菌液和160 μL的LB培養基，在恒溫培養箱中37℃培養24 h，以未接種菌體的LB培養基為對照；用酶標儀在600 nm讀數，測菌體吸光度；用PBS洗3次，劇烈搖動去除未黏附細菌，在室溫下干燥固定生物膜15 min；加入200 μL 0.1%的結晶紫染料染色30 min；用無菌水沖洗至對照孔為無色；用200 μL 95%乙醇溶解生物膜中的染料，室溫靜置10 min；將溶解的液體轉入新的96孔細胞培養板用酶標儀在波長595 nm處測定吸光值。

1.3.3 阪崎克羅諾桿菌在硅膠表面生物膜形成過程

硅膠的準備和清洗：參照文獻[14-15]方法，將食品級硅膠（1 cm×1 cm）樣片浸泡在含有15%磷酸溶液（phosphoric acid solution）燒杯中進行超聲波處理20 min，用蒸餾水沖洗，用中性洗滌劑洗1 min后用蒸餾水洗滌。將清洗干凈的樣片置于55℃干燥2 h，置于封閉的離心管中（用50 mL離心管），高壓蒸汽滅菌121℃，15 min。

在硅膠表面阪崎克羅諾桿菌生物膜培養：參照文獻[11，24]，將無菌的樣片浸泡在含有菌懸液2.0 mL的24 孔細胞培養板中，37℃培養，0、3、5、7、12、18、24、48h，在每個時間點取出培養好的樣片，進行后續的試驗。

1.3.4 阪崎克羅諾桿菌生物膜的掃描電鏡觀察

參照文獻[25]的方法，用無菌水洗去硅膠樣片表面未粘附的細菌，用2%戊二醛固定液4℃固定過夜，用0.1 mol/L的PBS（pH 7.2）沖洗 2次，再用1%的鋨酸（室溫）固定2h，用 0.1 mol/L PBS（pH 7.2）洗 2次，用25%、50%、70%、80%、90%系列濃度乙醇脫水各10 min，100%乙醇脫水兩次，每次15 min，通風櫥干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌在食品級硅膠表面生物膜的形成過程

阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在食品級硅膠片表面生物膜形成的變化過程，如圖1。

圖1 硅膠表面阪崎克羅諾桿菌生物膜形成Fig.1 C.sakazakii biofilm formation on silicone surfaces

食品級硅膠片對照組與在含有菌液的培養液中培養了 3、5、7、12、18、24、48 h 的硅膠片之間的 OD595值都具有顯著性差異。結果表明，從3 h開始，在硅膠表面已經有菌體粘附，具體分析如下：3 h與5 h之間的OD595值有顯著性差異，5 h與7 h之間的OD595值有顯著性差異，生物膜曲線呈現上升趨勢，這個階段浮游菌粘附于硅膠表面并且菌體數量劇增。7 h與12 h之間的OD595值無顯著性差異，12 h與18 h之間的OD595值無顯著性差異。7 h與18 h之間的OD595值具有顯著性差異，從菌株ATCC BAA-894的生物膜形成曲線的趨勢可以看到，這是個逐漸遞增的過程，生物膜的產量在不斷的增加，并且比較平穩。18 h與24 h之間的OD595值有顯著性差異，從曲線可以看出，培養時間達到24 h時菌株ATCC BAA-894的生物膜達到了最大生長量。24 h與48 h之間，生物膜形成量呈現明顯下降的趨勢。

2.2 阪崎克羅諾桿菌在食品級硅膠片表面生物膜形成的形態學觀察

阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在LB液體培養基中于食品級硅膠片表面的生物膜形成的過程中幾個關鍵階段的掃描電鏡形態圖片，如圖2。

圖2 阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在食品級硅膠片表面生物膜發育不同階段的掃描電鏡圖片Fig.2 Scanning microscope imaging of C.sakazakii ATCC BAA-894 biofilm developmental stages on silicone

0 h（圖A）時為無菌生長的硅膠表面結構。3 h（圖B）時硅膠表面有少量菌體粘附在了硅膠表面，菌體零散分布，形態正常。12 h（圖C）時硅膠表面的部分區域以“微菌落（microcolony）”形態存在，菌體簇狀聚集，菌體之間有多根鞭毛或菌毛樣結構相互連接，菌體分泌的胞外多聚物質（extracellular polymeric substances，EPS）包繞在微菌落周圍，并與硅膠表面牢固結合，使黏附更加牢靠。18 h時（圖D）硅膠表面的大部分區域生物膜微菌落更加密集，形成了大片的生物膜，并且厚度增加，出現了大量胞外聚合物將部分菌體以及微菌落包裹其中，并且從菌體的形態可以得知，菌體長度大多數在2 μm左右，細菌生長旺盛，菌體之間鞭毛或菌毛樣結構相互交錯，便于菌體之間的“交流”，基本形成了成熟的生物膜體系。24 h（圖E）時生物膜系統中微菌落之間的連接變得松散，并且生物膜表面有一些菌體形態發生了變化，菌體開始固縮，從桿狀變成了球狀。48 h（圖F）時硅膠表面菌體形態發生了很大的變化，部分菌體從桿狀變成了球狀，此外，在生物膜整個體系中由于菌體的死亡以及胞外聚合物的瓦解，瓦解后的生物膜系統骨架呈現出來，其上面粘附了大量死亡的菌體，“隔板”狀的結構縱橫交錯。

3 結論與討論

細菌生物膜的形成過程主要包括粘附、微菌落形成、成熟生物膜以及游離菌的播散與再次定植，這些階段貫穿了細菌生物膜生態系統的整個動態平衡過程[2-3]。根據掃描電子顯微鏡的觀察，我們發現阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在硅膠表面的靜態生物膜的形成過程。在3 h，我們認為阪崎克羅諾桿菌處在起始粘附階段（attachement）。在 5 h～12 h期間，可以界定為微菌落形成（microcolony）階段，菌體數量劇增并且定植于材質表面，菌體菌毛或鞭毛樣結構變得更多，菌體之間連接更緊密，并且開始分泌胞外多粘物質，相互吸引而聚集形成小菌落，并與材料表面牢固結合，使黏附更加牢靠。在12 h～24 h期間，可以界定為成熟生物膜（mature biofilm）階段，在硅膠的表面已經具有了成熟生物膜的雛形，從比較獨立的小菌落連成了成片的相互交錯的大菌落，在體系中出現了“隔板”樣的結構，這些“隔板”或許就是生物膜系統中的“水通道”，能夠運輸營養排泄代謝廢物，并且能夠保持濕潤的生物膜生態系統的正常運。從理論上來說，播散期（dispersal）是成熟生物膜可由活躍生長的細胞子代脫落、胞外聚合物或密度感應系統的自身程序化過程解聚，或者其他因素導致生物膜微菌落的分離，游離的細胞尋找新的定植環境[2-3]，但是這個動態的播散過程，無法在電鏡下面看到，我們的電鏡圖片觀察到，在24 h～48 h菌體形態發生了變化，在硅膠表面從桿狀固縮成了球狀，附著在隔板結構表面，我們推測，這可能與實驗室構建的生物膜培養環境有關，在這個時間段，由于培養基中營養物質耗盡，代謝廢物大量積累，環境pH值變化等等因素，導致了菌體的死亡與溶解。

在生物膜形成的整個動態過程中，菌體的粘附能力可能決定著生物膜不斷擴張的命運。菌體粘附能力的大小與被粘附材料的表面性質、菌體表面性質以及周圍生長環境的一些參數有關。通常，粘附可能發生在5 s～30 s，主要可以界定為可逆與不可逆粘附[26]。可逆粘附可能與范德華力和靜電力和疏水作用有關，在此階段，細菌容易被外界剪切力從表面清除。細菌的不可逆粘附發生在細菌表面附屬結構的錨定和細胞外多聚物質的產生[27]，如脂多糖的結構，粘附素和其他蛋白以及脂磷壁酸[3，28]。這些結構可能會有助于細菌粘附到非生物材料的表面[29-30]。一些研究表明，不可逆粘附在4℃～20℃時通常發生在20 min到4 h內[31-32]。要清除不可逆粘附的細胞是比較困難，需要借助于更強剪切力（擦洗或刮）和化學類清除劑，如酶，洗滌劑，表面活性劑，殺菌劑以及加熱作用[33-34]。硅膠具有較大的表面積及空容[15]，通常具有很大的吸附性。這種吸附性使得細菌更容易粘附在上面，并且形成成熟的生物膜。

由于食品加工環境的復雜性，本研究無法從靜態的電鏡圖片來說明生物膜的形成過程，但是，從形態的變化上，為生物膜的形成過程的研究提供了一點資料。通過以上分析，阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在3 h已經能粘附到硅膠表面，因此，在食品加工環境以及日常的食品制備結束后，要盡快清洗加工器械，以免產生食品污染的隱患。此外，應該結合其他更先進的生物膜培養技術和檢測技術，實時觀察或模擬食品加工環境中生物膜的動態形成過程，為能夠更好的控制食品加工環境中的生物膜尋找更好的策略。

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Morphological Observation of Cronobacter sakazakii Biofilm on the Surfaces of Silicone

JING Chun-e，LI Ping，DU Xin-jun，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Cronobacter sakazakii is an emerging pathogen which causes a life-threatening syndrome of meningitis，necrotizing colitis and meningoencephalitis in neonates and infants.Biofilm formed on the surface of silicone is an important possible source of clinical infections caused by this pathogen.Crystal violet staining method was employed to determine biofilm maturation curves of C.sakazakii ATCC BAA-894 on silicone.The processes of static biofilm formation on the silicone were investigated using the scanning electron microscope（SEM）.The bacteria on the surface had been observed to aggregate and grow into microcolonies，form 3-dimensional structures and communal relationships，resulting in a complex biofilm.In addition，the SEM revealed biofilm morphologies with variable amounts of extracellular polymeric substances，the presence of microcolonies and the mature biofilm formed between 12 h and 24 h.

Cronobacter sakazakii；biofilm；silicone；attachment；maturation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.037

“十二五”農村領域國家科技計劃課題（2014BAD04B03）作者簡介：景春娥（1985—），女（漢），博士研究生，研究方向：食品安全與檢測技術。

*通信作者：王碩（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品安全和免疫學檢測。

2015-07-28