大負荷運動對大鼠骨骼肌線粒體融合和分裂蛋白的影響

劉曉然　于　瀅　王蘊紅　閻守扶　王瑞元　李俊平

摘要：觀察大負荷運動后不同時間點骨骼肌線粒體融合與分裂蛋白的變化，分析與探究線粒體融合與分裂之間的關系及其生理意義。方法：56只SD大鼠經適應后分安靜對照組（8只）和運動組（48只），運動模型為一次中大強度離心跑臺運動，-16°，20 m/min，90 min。運動大鼠分別在運動后即刻、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h（各時間點8只）取比目魚肌。Western blotting方法分析骨骼肌Mfn1、Mfn2、Opa1、Fis1和Drp1的蛋白表達。結果：Mfn1蛋白在運動后即刻表達升高，而后降低，72 h為最低點；Mfn2蛋白在運動后呈先降后升的變化趨勢；Opa1蛋白在運動后表達先降低后升高，24 h為最高點，而后逐漸降低；Drp1蛋白在運動后表達升高，6 h出現高峰，而后逐漸降低；Fis1蛋白在運動后表達升高，12 h為最高點，而后在48 h和72 h表達降低。結論：一次大負荷運動后大鼠骨骼肌線粒體融合、分裂失衡，主要表現為線粒體分裂增強、線粒體融合抑制；而在運動恢復期，骨骼肌線粒體融合、分裂之間重塑平衡狀態。

關鍵詞： 大負荷運動；骨骼??；線粒體；動力學；融合；分裂

中圖分類號： G 804文章編號：1009783X（2016）02016705文獻標志碼： A

Abstract：The purpose of this study was to investigate the changes of mitochondrial fusion and fission in skeletal muscle induced by highload exercise，and to analyze the relations of mitochondrial fusion and fission.Methods：56 SD rats were divided into two groups：control group （8） and exercise group （48）.The rats should run on the treadmill，16 °，20m / min，90 minutes.The soleus were taken after exercise immediately，6 hours，12 hours，24 hours，48 hours and 72hours from the rats in exercise groups.WB was used to detect the protein expressions of Mfn1，Mfn2，Opa1，Fis1 and Drp1.Results：The expression of Mfn1 protein increased after the exercise，and then decreased gradually.And the lowest appeared at 72hour after the exercise.There were not remarkable changes of the expression of Mfn2 protein.The expression of Opa1 protein decreased after the exercise，and then increased gradually.And the highest appeared at 24hour after the exercise.The expression of Fis1 protein increased after the exercise，and the peak was at 12hour.But the expressions decreased at 48hour and 72hour after the exercise.Conclusion：A bout of highload exercise leads to imbalanced mitochondrial fission and fusion in skeletal muscle，shown by the enhanced mitochondrial fission and the declined mitochondrial fusion.And the balance of mitochondrial fusion and fission rebuilds after the exercise.

Keywords：highload exercise；skeletal muscle；mitochondria；dynamics；fusion；fission

生物體的很多生命活動，例如細胞能量代謝、發育和凋亡等，都與線粒體繁復的網絡結構有著密切的關系。線粒體是一種高度動態的細胞器，其形態時刻都處于變化中。它通過不斷的融合分裂，使其形態、分布、數量等都發生著改變，進而通過其氧化磷酸化產生ATP以適應運動過程能量需求的變化[1]。線粒體融合和分裂的動態過程通常被稱為線粒體動力學（mitochondrial dynamics），它對細胞能量代謝和收縮功能的維持起著至關重要的作用[2]。

現已發現一些線粒體動力學相關蛋白參與線粒體融合、分裂的精細調控。參與線粒體融合的蛋白主要包括線粒體融合蛋白1/2（Mfn1/2，mitofusin1/2）和視神經萎縮相關蛋白1（optic atrophy1，Opa1）。Mfn1和Mfn2位于線粒體外膜，主要調節線粒體外膜的融合；Opa1 主要調節線粒體內膜的融合。線粒體分裂相關蛋白則包括動力相關蛋白1（dynaminrelated protein 1，Drp1）和分裂蛋白1（fission protein1，Fis1）。兩者共同參與線粒體外膜的分裂程序。

目前，大量研究發現，適應強度的運動訓練可降低骨骼肌線粒體分裂蛋白的激活，線粒體融合趨向增強[3]，而關于大負荷強度運動對線粒體融合分裂的調控尚未見報道。本課題組在前期研究中已發現，大負荷運動可導致骨骼肌線粒體在形態結構和功能上均有一定程度的損傷[4]，而線粒體形態結構和功能與線粒體融合、分裂之間的聯系密不可分；故本研究以骨骼肌線粒體動力學為研究視角，建立大鼠大負荷運動模型，觀察一次運動后不同時間點線粒體融合蛋白（Mfn1、Mfn2和Opa1）、分裂蛋白（Drp1和Fis1）的表達變化，分析線粒體融合、分裂之間的關系及其生理意義，從而為探究大負荷運動導致的骨骼肌線粒體功能損傷提供更豐富的理論支持。

1材料（對象）與方法

1.1實驗動物與分組

雄性SD大鼠56只，SPF級，體重（196.16±6.96）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，在北京體育大學科研實驗中心小動物房內進行飼養和運動訓練。分籠飼養，自由飲食和飲水，室溫（22±2）℃，相對濕度30%～60%，12 h光照/12 h熄燈模擬日晝交替。

根據運動后不同時間點，將實驗動物分為7個組別，即安靜對照組（NC）、運動后即刻組（Ep0 h）、運動后6 h組（Ep6 h）、運動后12 h組（Ep12 h）、運動后24 h組（Ep24 h）、運動后48 h組（Ep48 h）和運動后72 h組（Ep72 h），每組8只，見表1。

1.2運動模型的建立

運動模型為一次中大強度離心跑臺運動，正式實驗前對運動組大鼠進行適應性跑臺訓練3 d。第1天坡度0°，16 m/min，10 min；第2天坡度-5°，16 m/min，15 min；第3天坡度-10°，16 m/min，30 min；第4天休息；第5天正式實驗，坡度-16°，20 m/min，90 min。

1.3測試樣本采集與處理

取材時間點設置為運動后的0、6、12、24、48和72 h。取材大鼠經腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.25 mL/100 g），腹主動脈取血，快速分離出比目魚肌，用錫紙包好，保存于液氮中，取材完成后將樣本全部保存至-80 ℃冰箱備用。

1.4Western blotting檢測

蛋白提?。喝∵m量樣品置于液氮研磨，稱取0.1 g組織，以1∶9加入預冷的裂解液，勻漿，冰上孵育20 min，4 ℃離心，12 000 r/min，20 min，取上清。

蛋白定量：采用BCA 測試法定量蛋白濃度。

取20 μg總蛋白配制成上樣體系，置95 ℃沸水中 5 min，上樣前離心。配制分離膠10%，以及5%積層膠。積層膠90 V，40 min；分離膠120 V，通過預染蛋白Marker來確定電泳停止時間。電泳后采用濕法進行蛋白質電轉印，300 mA，90～120 min。5% BSA封閉液室溫孵育2 h。以5% BSA封閉液稀釋一抗Mfn1（1∶500，abcam公司）、Mfn2（1∶1 000，abcam公司）、Opa1（1∶1 000，abcam公司）、Drp1（1∶10 000，Cell Signaling公司）、Fis1（1∶1 000，abcam公司）和GAPDH（1∶1 000，abcam公司），4 ℃ ，過夜。以5% BSA封閉液稀釋二抗（1∶5 000，中杉金僑公司），室溫孵育2 h。用ECL 發光試劑與膜在暗室中反應、曝光。X光片進行掃描后經ipp 6.0軟件對目的蛋白質進行光密度相對定量分析，將每個條帶與相應樣品的GAPDH條帶光密度值進行比較，計算出目的條帶的相對含量值。

1.5數據統計法

所有數據用SPSS 13.0統計軟件包處理，數據均以平均值±標準差（X±SD）的形式表示。一次性運動的實驗數據采用雙因素方差分析（Twoway ANOVA），對處理因素（安靜對照和運動）和不同的取材時間因素（運動后即刻、6、12、24、48和72 h）的主效應以及兩者的交互作用進行分析。如兩因素交互作用不顯著（P>0.05），則進一步建立非飽和模型進行分析；如兩因素交互作用顯著，則采用SNKq檢驗對不同組別間進行比較，并參考Bonferron法與Tukey法的比較結果。統計學顯著性水平定為P<0.05。

2結果

2.1一次大負荷運動對骨骼肌線粒體融合蛋白表達的影響

2.1.1大負荷運動后骨骼肌Mfn1蛋白表達的變化

實驗結果（表2，圖1）顯示，骨骼肌Mfn1蛋白表達在一次大負荷運動后即刻顯著升高了47.39%（P<0.05），運動后6、12、24、48 h蛋白表達均無明顯變化，但在運動后72 h Mfn1表達顯著降低了29.73%（P<0.05）。

2.1.2大負荷運動后骨骼肌Mfn2蛋白表達的變化

實驗結果（表2，圖2）所示，骨骼肌Mfn2蛋白表達在一次大負荷運動后即刻有下降趨勢，而在運動后6、12、24 h蛋白表達卻有升高趨勢，運動后48 h和72 hMfn2表達已基本降至安靜對照水平。

2.1.3大負荷運動后骨骼肌Opa1蛋白表達的變化

實驗結果（表2，圖3）顯示，骨骼肌Opa1蛋白表達在一次大負荷運動后即刻、6 h和12 h無明顯變化，但在運動后24 h蛋白表達顯著升高了62.49%（P<0.05），而運動后48 h和72 hOpa1表達已基本降至安靜對照水平。

2.2一次大負荷運動對骨骼肌線粒體分裂蛋白表達的影響

2.2.1大負荷運動后骨骼肌Drp1蛋白表達的變化

實驗結果（表3，圖4）顯示，骨骼肌Drp1蛋白表達在一次大負荷運動后即刻有升高趨勢，并在運動后6 h顯著升高36.73%（P<0.05），但在運動后12 h、24 h、48 h和72 hDrp1蛋白均無明顯變化。

2.2.2大負荷運動后骨骼肌Fis1蛋白表達的變化

實驗結果（表3，圖5）顯示，骨骼肌Fis1蛋白表達在一次大負荷運動后即刻和6 h有升高趨勢，并在運動后12 h顯著升高了33.45%（P<0.05），在運動后48 h和72 hFis1表達分別顯著降低了33.06%（P<0.05）和42.61%（P<0.05）。

3討論

3.1運動與骨骼肌線粒體融合

線粒體融合是一個復雜的生物過程，主要步驟包括：錨定、外膜融合、內膜融合和基質融合。Mfn1、Mfn2和Opa1在線粒體融合中發揮著各自的作用，且三者之間也存在著相互作用。Mfn1和Mfn2主要調節線粒體外膜的融合。Koshiba等[5]和Pich等[6]的研究發現：Mfn1和Mfn2的C端α螺旋區域可形成同源或異源二聚體，使2個臨近線粒體相互靠近，從而融合。Opa1主要調節線粒體內膜的融合。Opa1常以溶解形式定位于線粒體膜間隙或貼附于線粒體內膜，介導線粒體內膜的融合，而且其促融合作用依賴于Mfn1的參與[7]。

各種不同的生理刺激，例如冷環境暴露[8]、運動[910]和限制進食[11]等都可誘發線粒體動力學的改變。Mfn1/2表達上調可引起線粒體融合，使之趨于網絡化，而抑制Mfn1/2表達，線粒體則由網絡化趨向于分裂成單個線粒體[7]。Ngoh等[12]發現，誘導小鼠心肌Mfn2基因沉默可導致線粒體碎片化。Chen等[13]將H9C2細胞采用局部缺血的方式處理后可引起Opa1蛋白丟失，致線粒體片斷化。

本實驗發現，骨骼肌Mfn2和Opa1蛋白表達在運動后即刻均有表達下調的趨勢。這說明，一次大負荷運動可能會導致骨骼肌線粒體融合抑制。Picard等[9]的研究報道，C57小鼠經過3 h轉輪跑后趾長伸肌、紅腓腸肌和白腓腸肌的Mfn2和Opa1的蛋白表達均降低。孫衛東等[14]的實驗也觀察到大鼠骨骼肌線粒體Mfn2基因表達在一次急性運動過程中逐漸降低。實驗中還觀察到，Mfn1蛋白表達在運動后即刻顯著升高了47.39%，有悖于Mfn2和Opa1的變化。Picard等檢測比目魚肌時也觀察到Mfn2和Opa1的高表達[9]。究其可能原因，一是與比目魚肌以慢氧化型肌纖維類型為主有關，二是骨骼肌中Mfn2蛋白水平較高[15]，故Mfn1蛋白需大量表達才能與Mfn2形成二聚體結構。

在實驗中發現運動后6、12和24 h，Mfn1、Mfn2和Opa1蛋白均有不同程度的表達上調，其中Opa1在運動后24 h顯著升高了62.49%，說明骨骼肌線粒體已處于恢復狀態，趨向于線粒體融合。Cartoni等[16]的研究認為，人體在運動鍛煉24 h后骨骼肌細胞內Mfn1、Mfn2的mRNA表達顯著上升。漆正堂等[17]的實驗結果說明，大強度間歇性運動后24 h Mfn2基因轉錄和蛋白表達水平均升高。而陶小平等[18]在實驗中發現，一次定量大負荷運動后30、70和110 min Mfn2基因和蛋白表達均有不同程度的下降，而運動后110 min能基本恢復。本實驗結果顯示，運動后48 h和72 h Mfn2和Opa1蛋白表達均已恢復至安靜對照水平。運動負荷的大小與骨骼肌線粒體融合抑制程度呈正相關。

3.2運動與骨骼肌線粒體分裂

線粒體分裂是一個在進化中高度保守[19]的由一系列蛋白精確調控的復雜生物過程。受線粒體外膜分子Fis的趨化，Drp1從胞質轉位至線粒體外膜，并富集于潛在的分裂位點，圍繞線粒體形成指環結構，并通過水解GTP改變分子間的距離或角度，逐漸壓縮直至線粒體斷裂，產生2個獨立的線粒體。有研究發現線粒體分裂蛋白Drp1的突變可導致線粒體變長，抑制Drp1的表達可導致線粒體融合增強[19]。Smirnova等[20]發現Drp1突變體的過表達導致了核周圍簇狀線粒體的產生，并增加了線粒體間的連通性。Toshiyuki等[21]研究觀察到線粒體分裂蛋白Fis1和Drp1的沉默，可使3T3-L1前體脂肪細胞中的甘油三酯濃度下降，線粒體中Mfn 2和Opa1沉默，可提高甘油三酯濃度；同時還觀察到線粒體出現片段化，而且，Ashrafian等[22]研究發現，Drp1基因半敲除的小鼠心肌線粒體數量減少，ATP缺失。

本實驗發現，骨骼肌Drp1蛋白在運動后6 h表達顯著增加了36.73%，Fis1蛋白在運動后12 h表達也顯著增加了33.45%。這說明，一次大負荷運動后可能會誘導骨骼肌線粒體趨向分裂。劉慧君等[23]的實驗表明，以中等強度分別運動60 min和90 min，大鼠骨骼肌線粒體分裂蛋白Drp1 mRNA及蛋白表達較安靜組顯著升高，而且Drp1和Fis1蛋白的表達峰值分別出現在運動后6 min和12 min。從蛋白表達峰值的時序性上觀察，Mfn1/2和Opa1蛋白表達也是在運動后6 min或12 min出現低點。數據清晰地表明，線粒體融合蛋白Mfn1/2和Opa1蛋白和分裂蛋白Drp1和Fis1蛋白表達呈現相反的動態變化。

在實驗中還觀察到，Drp1蛋白和Fis1蛋白在運動后24 h已基本恢復到安靜對照水平，這與Ding的實驗結果一致，Fis1的轉錄水平和蛋白含量在運動進行至120～150 min時均明顯增加，且持續到整個恢復期直至運動后24 h[24]，而且，在運動后48 h和72 h，Drp1蛋白有明顯的表達下調趨勢，Fis1蛋白表達分別顯著降低了33.06%和42.61%。由此說明在運動后48～72 h，骨骼肌線粒體動力學趨于融合，在線粒體融合和分裂之間重塑平衡。

4結論

1）一次大負荷運動后大鼠骨骼肌線粒體融合、分裂失衡，主要表現為線粒體分裂增強、線粒體融合抑制，而在運動恢復期，骨骼肌線粒體融合、分裂之間重塑平衡狀態。

2）線粒體動力學是線粒體運動適應的一種早期機制，線粒體融合、分裂參與了細胞對能量需求的快速應答。一次大負荷運動干擾了骨骼肌線粒體動力學平衡，可能導致線粒體功能降低，骨骼肌能量代謝障礙。

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