以腦能量轉運蛋白為靶點研究通絡醒腦泡騰片的抗癡呆作用*

付文君，胡 勇，任香怡，魏江平，付 昆，徐世軍△

(1.四川省中藥資源系統研究與開發利用國家重點實驗室培育基地，成都 611137; 2.成都中醫藥大學，成都 611137)

以腦能量轉運蛋白為靶點研究通絡醒腦泡騰片的抗癡呆作用*

付文君1，2，胡 勇1，2，任香怡1，2，魏江平1，2，付 昆1，2，徐世軍1，2△

(1.四川省中藥資源系統研究與開發利用國家重點實驗室培育基地，成都 611137; 2.成都中醫藥大學，成都 611137)

目的:通過考察通絡醒腦泡騰片干預后MID模型大鼠海馬主要能量轉運蛋白表達揭示其抗癡呆的作用機制。方法:建立微血栓誘發的MID大鼠模型，給予通絡醒腦泡騰片干預90 d，采用Morris水迷宮評價大鼠的學習記憶功能，采用免疫組化和圖像分析法評價大鼠海馬GLUT-1、MCT-1和MCT-2的表達。結果:與模型對照組比較，通絡醒腦泡騰片能顯著縮短MID模型大鼠的逃避潛伏期，增加進入有效區域次數并延長有效區域停留時間，差異有統計學意義;通絡醒腦泡騰片能顯著促進模型大鼠海馬GLUT-1、MCT-1和MCT-2表達。結論:通絡醒腦泡騰片改善MID模型大鼠學習記憶功能的作用與其促進增強海馬能量轉運蛋白GLUT-1、MCT-1和MCT-2的表達有關。

通絡醒腦泡騰片;多發腦梗死性癡呆;葡萄糖轉運體-1;單羧酸轉運體-1;單羧酸轉運體-2

腦能量代謝障礙在阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)的發病中具有極其重要的地位和作用［1-2］，且日益受到關注和重視。課題組前期提出，老年癡呆是一種腦能量代謝障礙啟動的神經退行性疾病，腦能量代謝障礙貫穿于AD整個病程中，并發現Aβ海馬注射和雙側頸總動脈永久結扎2種AD模型大鼠海馬中丙酮酸脫氫酶(PDH)和α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDHC)活性顯著低下，表明該模型存在腦能量代謝障礙［3-4］。已知腦內能量的來源主要是葡萄糖和糖原分解產物乳酸，其中星形膠質細胞可以通過內皮細胞從血液中攝取葡萄糖，進而可將能量代謝底物運送至神經元［5-6］。葡萄糖轉運體-1 (Glucose Transporter-1，GLUT-1)、單羧酸轉運體-1 (Monocarboxylate Transporter-1，MCT-1)、單羧酸轉運體-2(Monocarboxylate Transporter-2，MCT-2)是能量底物轉運的關鍵蛋白，也是膠質細胞和神經元之間實現能量轉運的重要紐帶，其表達也間接反映腦能量水平的高低［7-8］。前期實驗研究發現，通絡醒腦泡騰片能改善東莨菪堿致癡呆小鼠模型、Aβ海馬注射大鼠模型和雙側頸總動脈永久結扎模型的學習記憶功能，其作用與促進細胞色素C氧化酶、PDH和α-KGDHC等環節有關［4，9］，表明通絡醒腦泡騰片具有改善癡呆模型腦能量代謝的作用，但其是否通過上述轉運體而發揮作用尚不清楚。為揭示其改善腦能量代謝的可能機制，本研究采用多發腦梗死性癡呆(multi-infarct dementia，MID)模型進行探討。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠80只，體質量280～320 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供(實驗動物合格證SCXK(川)2013-24)。

1.2 藥物與試劑

通絡醒腦泡騰片(1.2 g/片，含4.5 g原生藥/片)由四川同道堂藥業集團股份有限公司提供(批號20140215);甲磺酸雙氫麥角毒堿片(喜得鎮)，天津華津制藥有限公司(批號3H878T);單羧酸轉運蛋白-1抗體(MCT-1)兔多克隆抗體(批號 bs-10249R)、單羧酸轉運蛋白-2抗體(MCT-2)兔多克隆抗體(批號bs-3995R)、葡萄糖轉運蛋白-1抗體(GLUT-1)、兔多克隆抗體(批號bs-4855R)，均由北京博奧森生物技術有限公司提供;二抗和DAB顯色試劑盒由北京中山金橋生物有限公司提供。

1.3 主要儀器

WMT-100 Morris水迷宮、Y迷宮，成都泰盟科技有限公司;BA200 Digital數碼三目攝像顯微系統，麥克奧迪實業集團有限公司;Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統，美國Media Cybernetics公司。

2 方法

2.1 造模分組及行為測定

表1顯示，采用微血栓栓塞法制備MID大鼠模型［10］。大鼠麻醉后暴露左側頸動脈，分離出頸外動脈，從總動脈“Y”型分岔處緩慢注入0.4 ml含血栓的生理鹽水混懸液，注射后結扎頸外動脈近心端。假手術組動物注射生理鹽水，其余步驟與模型動物相同。造模后連續3 d肌注硫酸慶大霉素(0.1 ml/ 100 g)，10 d后采用“Y”迷宮［12］選取MID的模型(錯誤次數≥6)大鼠50只，隨機分成模型對照組、喜得鎮組(0.7 mg/kg)、通絡醒腦泡騰片高、中、低(7.56、3.78、1.89 g/kg)5組各10只，另隨機取10只注射生理鹽水的大鼠作為假手術組共6組;10 ml/kg灌胃給予相應藥物，連續90 d，每日1次。給藥第86天時進行Morris水迷宮實驗［11］，連續5 d，末次給藥后1 h測定大鼠逃避潛伏期、有效區域進入次數及有效區域停留時間，評價大鼠學習記憶水平。

2.2 免疫組化法測定相關蛋白含量

Morris實驗結束后24 h麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌注固定，冰上取腦，石蠟包埋、切片，采用免疫組化SP法測定GLUT-1、MCT-1、MCT-2蛋白含量。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統進行圖像分析，并測定平均光密度(IA)。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 通絡醒腦泡騰片對MID模型大鼠學習記憶功能的影響

與模型對照組比較，通絡醒腦泡騰片高、中、低3個劑量組大鼠的逃避潛伏期均顯著縮短，低劑量組進入有效區域的次數顯著增多，進入有效區域的停留時間顯著延長，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 通絡醒腦泡騰片對MID模型大鼠學習記憶功能的影響(±s)

表1 通絡醒腦泡騰片對MID模型大鼠學習記憶功能的影響(±s)

注:與假手術組比較:#P＜0.05;與模型對照組比較:*P＜0.05

組別 鼠數 劑量g/kg 逃避潛伏期(s) 有效區域進入次數(次) 有效區域停留時間(s)假 手 術 組 10 —11.40± 9.89 6.60±1.35 3.96±1.45模 型 對 照 組 10 — 72.06±47.12# 3.10±3.11# 1.60±1.95#喜 得 鎮 組 10 0.7mg 24.57±34.69* 6.30±2.87* 3.32±1.53*通 絡醒腦高劑量 組 10 7.56 50.87±39.37* 3.80±2.82 2.61±1.53通 絡醒腦中劑量 組 10 3.78 52.14±51.37* 5.00±4.90 2.79±2.39通 絡醒腦低劑量 組 10 1.89 29.81±28.85* 6.33±2.50* 3.46±1.71*

3.2 通絡醒腦泡騰片對模型大鼠海馬GLUT-1、MCT-1和MCT-2表達的影響

3.2.1 通絡醒腦泡騰片對 MID大鼠海馬GLUT-1蛋白表達的影響 GLUT-1陽性表達為淺黃色或棕黃色，主要表達于細胞漿、細胞膜(圖1A)。圖1顯示，與假手術組比較，模型對照組海馬GLUT-1表達減少(P＜0.05);與模型對照組比較，通絡醒腦泡騰片高、中劑量組GLUT-1表達顯著增高(P＜0.05)。

3.2.2 通絡醒腦泡騰片對 MID大鼠海馬MCT-1/MCT-2表達的影響 MCT-1、MCT-2主要表達于細胞漿、細胞膜，陽性表達為淺黃色或棕黃色(圖2A和圖3A)。圖2、3顯示，與假手術組比較，模型對照組大鼠 MCT-1、MCT-2表達降低(P＜0.05);與模型對照組比較，通絡醒腦泡騰片3個劑量組的MCT-1表達明顯增強(P＜0.05)，但MCT-2僅高劑量組較模型對照組顯著升高(P＜0.05)。

3 討論

圖1 通絡醒腦泡騰片對MID大鼠海馬GLUT-1表達的影響(×400)

圖2 通絡醒腦泡騰片對MID大鼠海馬MCT-1表達的影響(×400)

AD的腦能量代謝下降首先出現于與記憶相關的腦區，如海馬和內嗅皮層［12］，腦能量代謝主要涉及能量底物的運輸及細胞內的氧化代謝，而腦的必須和主要的能量代謝底物就是葡萄糖［13］。由于腦組織無法自身合成葡萄糖，因此葡萄糖的轉運在腦能量的供應中居于關鍵地位。星形膠質細胞在腦能量轉運中扮演著從血液中吸收葡萄糖并將能量代謝底物運送給神經元的角色。眾所周知，ATP是能量的直接來源，三羧酸循環(TCA)是產生ATP的主要方式。丙酮酸作為TCA的中間產物，當腦缺血缺氧狀態下，乳酸可經乳酸脫氫酶-1(LDH-1)催化生成丙酮酸，丙酮酸進入TCA后合成ATP，促進腦缺血損傷的快速修復［14］。在AD病理狀態下，GLUT1和GLUT3對于葡萄糖的運輸發揮著重要作用［15］。當腦內葡萄糖降低時，儲存于星形膠質細胞的糖原被分解為乳酸，乳酸作為神經元的功能物質以維持神經元的代謝［16-17］。大鼠腦缺血模型證明，腦缺血后乳酸成為主要的能量底物，加速修復缺血導致的神經元損傷［18］，并在乳酸和葡萄糖同時存在時，神經元更傾向于代謝乳酸［19］。但腦中的乳酸不能直接從血液中獲取，其來源于GLUT-1加速葡萄糖透過血腦屏障并經GLUT-3轉運至神經膠質細胞，然后在LDH-5催化下生成［20］。生成的腦乳酸經MCT-1/ MCT-4釋放到細胞間隙中，再經MCT-2攝取至神經元后由LDH-1催化成丙酮酸參與TCA供能［21］。

圖3 通絡醒腦泡騰片對MID大鼠海馬MCT-2表達的影響(×400)

本次研究結果表明，MID模型大鼠逃避潛伏期顯著延長，空間探索功能有障礙(有效區域進入次數減少，有效區域停留時間縮短)，而海馬GLUT-1、MCT-1和MCT-2蛋白表達亦明顯減少。通絡醒腦泡騰片干預后，模型大鼠的逃避潛伏期縮短，有效區域進入次數增多和停留時間延長，且海馬中GLUT-1、MCT-1和MCT-2的表達也顯著增高。上述研究結果與MCAO大鼠模型文獻［22-23］報道結果不一致。文獻認為，MCAO大鼠腦組織中GLUT-1、MCTs表達明顯增強，并認為可能與動物的代償反應有關，高表達的GLUT-1、MCTs能夠通過提高腦能量轉運緩解缺血所造成的能量供應不足［13-14］。造成結果不一致的原因，一是該文獻有再灌注損傷過程，提示腦缺血再灌注損傷后腦組織病理修復機制可能與多發性腦腔梗不同;二是本研究造模后持續給藥干預時間達3個月，病理損傷已經為失代償期，長時間腦缺血損傷后僅依靠乳酸代謝產能可能無法維持大腦高耗能體系的運轉，當腦內能量逐步耗竭，能量底物轉運相關基因無法表達，蛋白質合成受阻［1，24］，導致其表達降低，具體原因有待進一步的深入研究。

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Anti Dementia Effects of Tongluo Xingnao Effervescent Tablet With the Target of Brain Energy Transporter

FU Wen-jun1，2，HU Yong1，2，REN Xiang-yi1，2，WEI Jiang-pin1，2，FU Kun1，2，XU Shi-jun1，2△
(1.Sichuan Provincial Key Laboratory，Systematic Research and Development of Chinese Medicinal Resources，Province-Ministry Co-constructed State Key Lab Incubation Base，Chengdu 611137，China; 2.Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China)

Objective:To study the effect of Tongluoxingnao effervescent tablet(TLXNET)on the expression of energy transport-related proteins in multi-infarct dementia(MID)rats in order to explore its mechanism of anti-dementia.Methods:Microthrombus was used to establish MID model rats which were intervened by gastric infusion of TLXNET for 90 d.Evalneting the learning and memory ability of MID model rats via Morris water maze.Additionally the expressions of GLUT-1，MCT-1 and MCT-2 in hippocampal were measured by immunohistochemical and image analysis.Results: Compared with the model control group，TLXNET could significantly reduce the escape latency，increase times of entrance into the valid region and prolong the residence time of MID model rats，which all revealed a significant statistic;meanwhile the expressions of GLUT-1，MCT-1 and MCT-2 were notably raised after administration of TLXNET，with an increase in the average optical density.Conclusion:TLXNET can improve learning and memory deficit which is related with promoting the expression of energy metabolism-related proteins transportation such as GLUT-1，MCT-1 and MCT-2.

Tongluoxingnao effervescent tablet;Multi-infarct dementia;GLUT-1;MCT-1;MCT-2

R285.5

B

1006-3250(2016)12-1612-04

2016-05-24

“重大新藥創制”科技重大專項(2013ZX09103002-008)-腦絡重塑治療老年癡呆新藥—通絡醒腦微丸的研究;四川省杰出青年學術技術帶頭人計劃項目(2011JQ0014)-芩芎當歸解毒益智方對Aβ代謝的調控及機制研究;成都市產業發展技術支撐計劃—高校院所應用基礎研究項目(12DXYB321JH-002)-通絡醒腦泡騰片抗老年癡呆的代謝組學及改善認知的機構基礎研究

付文君(1992-)，女，新疆伊犁人，在讀碩士，從事中藥神經與精神藥理學的臨床與研究。

△通訊作者:徐世軍(1975-)，男，甘肅靜寧人，教授，從事中藥神經與精神藥理學的臨床與研究，Tel:028-61800231，E-mail:docxu@126.com。