湖羊SPLUNC1基因序列的生物信息學分析

陳凱麗 孫延鳴++沈文++陳冬梅 +郭海英

摘要：以湖羊SPLUNC1基因為研究對象，利用生物信息學方法對其編碼的蛋白進行理化性質、信號肽、跨膜區域、亞細胞定位、二級結構、三級結構、保守區域分析，并構建系統發育樹。結果表明，湖羊SPLUNC1蛋白的分子量為26.53 ku，理論等電點為5.07。SPLUNC1蛋白N端存在信號肽，亞細胞定位在細胞外。SPLUNC1蛋白質的二級結構主要為α螺旋和無規則卷曲。該蛋白由4 股反平行的肽段形成的β折疊片和2個α螺旋組成的桶形結構域組成。系統發育樹分析表明，湖羊的SPLUNC1蛋白在山羊、牛、豬、人、小鼠中，與山羊首先聚為一類，后與牛聚為一類，這與動物學分類結果一致。

關鍵詞：湖羊；短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）；生物信息學分析

中圖分類號： Q781文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0048-03

收稿日期：2015-01-27

基金項目：國家自然科學基金（編號：31460686）

作者簡介：陳凱麗（1988—），女，河南南陽人，碩士，主要從事動物學研究。E-mail：kellyhenan@163.com。

通信作者：孫延鳴，博士，教授，主要從事臨床獸醫學研究。E-mail：sym@shzu.edu.cn。

短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（short palate，lung and nasal epithelium clone 1，[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]）因其特異表達于上腭、肺及鼻咽上皮而被命名。Weston等首次克隆了小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因[1]。SPLUNC1具有分泌物的生化特性[2]，分布于細胞胞漿中[3]。人、小鼠、牛、豬[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]分別定位于20號染色體、2號染色體、13號染色體、17號染色體。研究表明哺乳類動物物種擁有共同的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]表達模式，即在口咽部、上呼吸道、唾液腺和氣管表達，且在革蘭陰性細菌引起的呼吸道感染中能起到抗菌及抗炎雙重作用[4]。Liu等證明了SPLUNC1是吸道病原菌感染肺部黏膜固有免疫防御相關決定性成分[5]。Chu等證實SPLUNC1是一種新的宿主防御肺炎支原體蛋白，體內過表達的SPLUNC1能顯著地抑制肺部肺炎支原體的載荷量[6]。此外，SPLUNC1在維持上呼吸道穩態方面也起了重要的作用[7]。目前，有關人和小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因功能已有相關報道，但未見有關羊的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]相關功能及其生物信息學分析的報道。在此前的研究中，筆者采用RACE技術，從湖羊的肺組織中克隆得到[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA序列，并在GenBank上登錄（登錄號：KJ749828.1）。本研究利用生物信息學方法對湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因序列進行分析，為進一步研究湖羊SPLUNC1蛋白的生物學功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1生物信息學數據庫和軟件

NCBI（美國生物技術研究中心）：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blastEXPASY：http：//www.us.expasy.ch（蛋白質數據庫）；MEGA 5.05軟件；RasMol軟件。

1.2湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因cDNA全長的獲得

從湖羊肺組織中提取RNA，利用RACE技術分別擴增出[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]的3′末端和5′末端序列并送基因公司測序，用DNAMAN軟件將測序結果進行拼接，獲得湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA 的全長序列。湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA的全長序列的具體克隆步驟參照文獻[8]。

1.3生物信息分析方法

利用在線分析工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的蛋白質進行氨基酸理化分析。利用在線分析工具NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的蛋白質進行糖基化位點分析。利用在線分析工具WoLF PSORT（http：//wolfpsort.org）、TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和SignalP-3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）對湖羊SPLUNC1蛋白在真核細胞的亞細胞位置和信號肽進行分析。利用在線分析工具TMPred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）對湖羊SPLUNC1蛋白進行跨膜區分析。利用在線分析工具SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測湖羊SPLUNC1蛋白二級結構進行分析。利用NCBI的在線分析工具Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome）對湖羊SPLUNC1蛋白的保守結構域進行預測。利用在線分析工具3D-PSSM（http//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）和RasMol軟件對湖羊SPLUNC1蛋白的三級結構進行分析。利用NCBI 的在線分析工具Blast對湖羊的SPLUNC1進行氨基酸序列比對。利用MEGA 5.05構建湖羊SPLUNC1蛋白的分子進化樹。

2結果與分析

2.1湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因基本信息與理化性質分析

研究利用ExPaSy蛋白數據庫中的ProtParam在線工具對湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的蛋白質（GenBank登錄號：AIG92771.1）進行氨基酸理化性質分析，結果表明，蛋白質分子式為C1206H2031N305O348S5，原子總數為3 895，蛋白質分子質量為26.53 ku，理論等電點為5.07；不穩定系數為 29.88，說明該蛋白為穩定蛋白；脂肪系數為152.08，總平均親水性為0.704，說明該蛋白是疏水蛋白。湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的255個氨基酸中含量最高的是Leu、Gly 和Val，各有62個、24個和24個，分別占24.3%、9.4%和9.4%，且不含有Pyl、 Trp和Sec。利用NetNGlyc 1.0 Server預測N-糖基化序列，發現湖羊的SPLUNC1序列中含有2個糖基化序列，分別是：NITA和NLTG。由圖1可知，使用亮氨酸拉鏈公式：Leu-X6-Leu-X6-Leu-X6-Leu （X 指代任意氨基酸殘基），在N末端發現了亮氨酸拉鏈序列。

[FK（W6][TPCKL1.tif][FK）]

2.2湖羊SPLUNC1蛋白的信號肽、亞細胞定位及跨膜區域分析

結合Emanuelsson1等和Paul等的亞細胞定位方法對湖羊的SPLUNC1進行信號肽、亞細胞定位分析[9-10]。使用這2篇文獻中提到的在線分析工具進行分析。

WoLF PSORT預測運用最鄰近結點算法（k-nearest neighbor algorithm，KNN），K值為32，queryProtein details extr：28，E.R.：3 （extr即extracellular細胞外的，E.R.即內質網）。點擊網頁結果中的”details“查看與湖羊SPLUNC1匹配的32個蛋白中，有28個與細胞外蛋白相似，且評論大部分為分泌蛋白；有3個與內質網有關，1個與溶酶體蛋白相似。

TargetP 1.1 Server結果表明湖羊SPLUNC1具有分泌途徑，且含有19個氨基酸的信號肽。

按照Emanuelsson1等的建議[9]，對TargerP 1.1 Server預測的信號肽使用SignalP-3.0進行再次分析，得出的結果采用neural networks （NN）算法，湖羊SPLUNC1蛋白的信號肽切割位點為第19個氨基酸和第20個氨基酸之間（圖2）。

[FK（W10][TPCKL2.tif][FK）]

利用在線TMPred工具對目標蛋白質進行跨膜區預測，結果為：有2個可能的模型值得考慮，其中一個模型是N末端在內部，有2個大的跨膜螺旋，分別位于1～21位氨基酸（由內到外），47～68位氨基酸（由外到內），總分：2 611；另一種模型是有1個大的跨膜螺旋，位于1～19位氨基酸（由外到內），總分：1 260（圖3）。

[FK（W10][TPCKL3.tif][FK）]

綜上所述，湖羊SPLUNC1蛋白含有1個19位氨基酸的信號肽，亞細胞定位于細胞外，有2個大的跨膜螺旋。

2.3湖羊SPLUNC1蛋白二級結構預測分析

本研究利用SOPMA工具預測該基因編碼蛋白質的二級結構，結果顯示參與形成螺旋（alpha helix）的氨基酸有135個、占52.94%，參與形成延伸直鏈（extended strand）的氨基酸有38個，占14.90%，參與形成無規則卷曲（random coil）的氨基酸有69個，占27.06%。二級結構分布見圖4。

[FK（W9][TPCKL4.tif][FK）]

2.4湖羊SPLUNC1蛋白三級結構預測分析

本研究利用SWISS-MODEL蛋白質三維結構建模工具預測湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼蛋白質的三維結構，獲得該蛋白的三維結構模型。使用SWISS-MODEL模板庫匹配靶序列的進化相關結構進行Blast和HHBlits搜索，在匹配的23個模板里，模板4 kgo.1.A與湖羊SPLUNC1序列的相似最高。使用RasMol軟件查看預測結果，發現該蛋白由4 股反平行的肽段形成的β折疊片和2個α螺旋組成的桶形結構域組成（圖5）。

2.5湖羊SPLUNC1蛋白保守區域預測

利用NCBI的Blast比對預測湖羊SPLUNC1的結構域，由圖6可見，湖羊SPLUNC1蛋白有2個結構域，其中第58個氨基酸到第233個氨基酸構成的保守結構域與LBP_BPI_CEPT結[CM（25]構域相似，第104個氨基酸到第231個氨基酸構成的保守[CM）]

[FK（W6][TPCKL5.tif][FK）]

結構域與BPI1結構域相似。

2.6湖羊SPLUNC1蛋白的系統發育樹分析

使用NCBI 的Blast在線工具對湖羊SPLUNC1的氨基酸進行序列比對，結果表明，湖羊與山羊、家牛、豬、人、小鼠物種相似性為98%、92%、78%、79%、67%。利用Clustal X 1.81軟件對6個物種[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因氨基酸序列進行比對，然后使

[FK（W6][TPCKL6.tif][FK）]

用MEGA 5.05的鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）基于該基因氨基酸序列的比對結果構建6個物種的系統發育樹，進而反映不同物種的系統進化及親緣關系（由圖7可見，分支節點處數字為1 000次Bootstrop檢驗的支持百分比）。結果表明，湖羊和山羊的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因同屬一個分支，親緣關系比較密切，聚為一類，隨后這2者與牛聚為一類，而后與豬聚為一類，而人和小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因單獨為1支。

[FK（W9][TPCKL7.tif][FK）]

3結論與討論

本研究通過DNAMAN、NCBI等在線工具和軟件，對湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因的蛋白結構和功能進行了分析。由分析結果可知，克隆的湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因cDNA全長（GenBank登錄號：KJ749828.1）為1 091 bp，含1個完整的開放閱讀框（ORF）768 bp，共編碼255個氨基酸。將湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因翻譯的氨基酸序列與已發表文章小鼠和豬[1，11]SPLUNC1的信息進行比較，發現湖羊的SPLUNC1與小鼠在N端都有亮氨酸拉鏈，且排列的位置相同。小鼠的為MFLVGSLVVLCGLLAHSTAQLAGLPLPL，湖羊的為MFQIGSLIVLCGLLAQTTALLEALPVPL，豬的N端未發現，表明亮氨酸拉鏈在物種進化上存在差異。另外小鼠的糖基化序列是NPTD、NITA和NLTG，湖羊是NITA和NLTG，豬只有1個糖基化序列NITV。同時，在小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]序列上發現的PLPL結構域以及保守結構域蛋白激酶C（SLK）和酪蛋白激酶Ⅱ（SFVD和SGLD）在湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]上沒有被發現，而豬的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]序列上卻發現有蛋白激酶C（SLK）序列。

最早先采用的是信號肽預測軟件SignalP 4.0分析湖羊SPLUNC1蛋白，發現信號肽切割位點在23～24，而報道的小鼠和豬的信號肽切割位點在19～20之間，人的SPLUNC1 蛋白的N 端的信號肽長度為19個氨基酸[12]，但是結合了亞細胞定位后，支持了信號肽切割位點為19～20。在亞細胞定位時參考了孫偉等和杜慕云等的亞細胞定位方法[13-14]，對序列進行分析發現，用Signal 3.0分析有2個結果，neural networks （NN）的分析結果為信號肽切割位點為 19～20，hidden Markov models （HMM）的分析結果為信號肽切割位點為23～24。綜合比較后，判斷湖羊SPLUNC1的信號肽切割位點應為 19～20之間，但是仍需試驗數據支持。

從近些年的研究報道中，可以看出大部分的SPLUNC1生物學研究功能主要在人和鼠上，鮮見羊SPLUNC1生物學功能的相關報道。此次研究運用生物信息學的方法對湖羊SPLUNC1蛋白的基本理化性質、信號肽、跨膜區域、二級結構等進行分析，初步預測了湖羊SPLUNC1蛋白所擁有的部分特性，以期為深入探討其生物學功能提供理論依據。

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