白花擬萬代蘭（Vandopsis undulata）組培苗的增殖、生根與煉苗

林夏斌++黃華達(dá)++黃懷妹+++彭東輝+++翟俊文+++吳沙沙

摘要：白花擬萬代蘭（Vandopsis undulata）花大素雅，具芳香，有很高的觀賞價值，并有很大的市場前景。為縮短白花擬萬代蘭從無菌播種到成苗的時間并保證組培苗移栽成活率，以無菌播種獲得的白花擬萬代蘭小苗為材料，合并其增殖和生根階段最適培養(yǎng)基的篩選，繼而對最適移栽基質(zhì)進(jìn)行了篩選研究。結(jié)果表明，叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA +250 mL/L 椰子汁，平均增殖系數(shù)達(dá)3.57；叢生芽生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+50 mL/L椰子汁；所用移栽基質(zhì)中，泥炭土和木屑對白花擬萬代蘭栽培成活率有顯著影響，最優(yōu)的基質(zhì)體積配比為：苔蘚 ∶[KG-*3]泥炭土 ∶[KG-*3]珍珠巖 ∶[KG-*3]木屑=1 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2 ∶[KG-*3]2。

關(guān)鍵詞：白花擬萬代蘭；組織培養(yǎng)；移栽基質(zhì)；6-BA；NAA

中圖分類號： S682.310.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0056-04

收稿日期：2015-09-08

基金項(xiàng)目：福建省特色花卉品種創(chuàng)新與種苗設(shè)施繁育產(chǎn)業(yè)（編號：2014S1477-7）。

作者簡介：林夏斌（1990—），男，碩士研究生，主要從事園林植物應(yīng)用研究。E-mail：xiabinlin1916@126.com。

通信作者：吳沙沙，博士，講師，從事園林植物資源與應(yīng)用研究。E-mail： shashawu1984@126.com。

白花擬萬代蘭（Vandopsis undulata）為蘭科（Orchidaceae）擬萬代蘭屬典型的熱帶附生蘭，產(chǎn)中國云南南部至西北部（勐海、騰沖和怒江河谷）、西藏東南部（墨脫、背崩），生于海拔1 800～2 200 m的林中樹干上，尼泊爾、錫金、不丹和印度東北部也有分布[1]。在蘭科植物中，擬萬代蘭屬約5種，目前，均未實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)供應(yīng)市場，野外資源急需保護(hù)和人工擴(kuò)繁[2]。白花擬萬代蘭花大素雅，具芳香，有很高的觀賞價值，具有很大的市場前景。擬萬代蘭屬約有5種，中國僅有擬萬代蘭（V. gigantea）和白花擬萬代蘭2個種。蘭科植物單個果實(shí)種子量大是其顯著優(yōu)勢，利用種子進(jìn)行大規(guī)模繁殖是對保護(hù)蘭科植物的重要手段[3]。蘭花種子又稱種胚，其細(xì)如粉塵，只有在顯微鏡下才能看清，沒有胚乳，處于原胚階段，缺乏營養(yǎng)[4-5]，多數(shù)蘭科植物依靠其自身營養(yǎng)則難于萌發(fā)，因此外源營養(yǎng)對蘭花種子的萌發(fā)顯得尤其重要[6]。傳統(tǒng)的繁殖方式，繁殖系數(shù)低、速度慢[7]，不能滿足日益增長的市場需要。找到一個快速繁殖種苗的方法對其種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用將具有重要的現(xiàn)實(shí)和理論意義。

本試驗(yàn)采用不同培養(yǎng)基配方、栽培基質(zhì)，對白花擬萬代蘭增殖、生根及組培苗移栽成活率進(jìn)行了研究，探討在無菌培養(yǎng)、移栽過程中不同因素對其成活、生長發(fā)育的影響，以期獲得最適宜的無菌培養(yǎng)配方和移栽條件，為提高白花擬萬代蘭的繁殖系數(shù)，獲得大量優(yōu)質(zhì)組培苗提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

2013年9月，對購自云南騰沖的白花擬萬代蘭植株上未開裂果莢內(nèi)的種子進(jìn)行無菌播種，所用培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+8 g/L 瓊脂+30g/L蔗糖+2 g/L活性炭。叢生芽的增殖與生根培養(yǎng)材料來源于無菌播種90 d的無根種胚苗。煉苗所用植物材料為生根培養(yǎng)90 d的組培苗。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1叢生芽的增殖與生根

以無菌播種90 d后，芽長為0.5～1.0 cm尚未生根的白花擬萬代蘭小苗為材料，采用 L9（34） 正交試驗(yàn)研究不同基本培養(yǎng)基、6-BA、IAA、椰子汁（新鮮椰子汁）對叢生芽增殖和生根的影響（表1）[8]。每瓶接種7株（圖1-A），每個處理30瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件為：溫度（25±2） ℃，相對濕度70%～80%，光照度1 000～1 500 lx，光照時間12 h/d。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計增殖數(shù)、生根數(shù)、葉片數(shù)，測量根長，并對每個處理中隨機(jī)選擇的10株植物進(jìn)行生長狀況評分，以1～4分計：1表示植株長勢差， 增殖數(shù)

少，出現(xiàn)褐化；2表示長勢整齊，但增殖數(shù)少或植株欠健壯；3表示長勢整齊，植株根系健壯，莖葉生長良好；4表示長勢整齊，植株健壯，新生芽多而飽滿。根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果，篩選適合白花擬萬代蘭叢生芽增殖和生根的最適培養(yǎng)基。

1.2.2煉苗移栽

將生根壯苗后的組培苗放置于人工氣候箱中進(jìn)行煉苗，培養(yǎng)條件為：溫度（25±2） ℃，光照度1 000～1 500 lx，光照時間12 h/d。選擇大小適合的組培苗，將其在人工氣候箱中閉瓶培養(yǎng)10 d，開瓶培養(yǎng)1 d后[9]，從培養(yǎng)瓶中取出幼苗，用清水洗凈培養(yǎng)基，再用1 000倍75%可濕性多菌靈溶液浸泡處理12 h，自來水沖洗后備用（圖1-B）。以苔蘚、泥炭土、珍珠巖、木屑4種基質(zhì)為4個因素，每因素1、2、3 3個體積比例作為3個水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計配置移栽基質(zhì)研究其對白花擬萬代蘭組培苗移栽成活率的影響。移栽后置于溫室中培養(yǎng)，溫室環(huán)境條件為：溫度（25±2） ℃，光照度1 000～1 500 lx，光照時間12 h/d，60 d后統(tǒng)計白花擬萬代蘭組培苗移栽成活率。

1.2.3數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較[10]；采用以下公式進(jìn)行原球莖的增殖系數(shù)、生根率、平均根長、平均葉片數(shù)的計算。

增殖系數(shù)=增殖后芽數(shù)/接種外植體數(shù)[11]；

生根率=（生根植株總數(shù)/接種植株總數(shù)）×100%；

平均根長=所有植株總根長/總根數(shù)；

平均葉片數(shù)=植株葉片總數(shù)/總株數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理對叢生芽增殖的影響

叢生芽增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，MS作為基本培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L6-BA、0.2 mg/L IAA、250 mL/L椰子汁時，叢生芽的增殖系數(shù)達(dá)到最高水平，為3.57，且生長狀況良好，植株大小整齊，植株根莖健壯，新生芽多（圖1-C）。根據(jù)各因素R值大小可知，4種因素對增殖系數(shù)的影響強(qiáng)弱表現(xiàn)依次為基本培養(yǎng)基類型>椰子汁>IAA>6-BA（表2）。白花擬萬代蘭叢生芽增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+250 mL/L椰子汁；最不理想培養(yǎng)配方為：KC+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+250 mL/L椰子汁。二者的差別在于基本培養(yǎng)基和激素濃度，MS基本培養(yǎng)基更有利于白花擬萬代蘭的增殖，適宜的激素濃度有利于白花擬萬代蘭的增殖，過高的激素濃度反而抑制白花擬萬代蘭的增殖。

不同處理對白花擬萬代蘭增殖系數(shù)的影響差異較大，6-BA對白花擬萬代蘭增殖系數(shù)的影響小。方差分析結(jié)果，培養(yǎng)基F值為24.902、椰子汁F值為14.016、IAAF值為12319，對白花擬萬代蘭叢生芽增殖的影響顯著，6-BAF值為0.081，對叢生芽增殖的影響不顯著（表3）。

2.2不同處理對叢生芽生根的影響

從表4可以看出，當(dāng)椰子汁含量為50 mL/L、IAA 0.5～1.0 mg/L 時，生根數(shù)和根長均達(dá)到較高值，當(dāng)IAA濃度低于0.5 mg/L時則不利于生根。通過比較Ra值可知，不同因素對白花擬萬代蘭叢生芽根長的影響主次關(guān)系依次為：椰子汁>基本培養(yǎng)基類型>6-BA>IAA。不同因素對白花擬萬代蘭叢生芽生根數(shù)量的影響主次關(guān)系依次為：IAA>基本培養(yǎng)基類型>椰子汁>6-BA。在基本培養(yǎng)基為VW，添加1.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L IAA、50 mL/L椰子汁的培養(yǎng)基中，白花擬萬代蘭組培苗平均根長最長，為0.48 cm。當(dāng)基本培養(yǎng)基為KC、6-BA質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/L、IAA 質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/L、椰子汁濃度達(dá)到250 mL/L時，平均生根數(shù)達(dá)最多，為2條（圖1-D）。白花擬萬代蘭生根培養(yǎng)的最佳配方[JP3]處理為：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+50 g/L椰子汁。

不同處理對白花擬萬代蘭叢生芽生根數(shù)量的影響差異較大，6-BA對白花擬萬代蘭叢生芽生根的影響最小。方差分析表明，椰子汁F值為16.397，對叢生芽根長的影響顯著；IAA F值為13.138，對叢生芽生根的影響顯著；6-BA F值為0.397，對叢生芽根長的影響不顯著（表3）。椰子汁對白花擬萬代蘭叢生芽新生根系數(shù)量有一定的促進(jìn)作用。

2.3不同處理對葉片數(shù)量的影響

根據(jù)各因素R值大小可知，4種因素對白花擬萬代蘭葉片數(shù)量的影響強(qiáng)弱依次表現(xiàn)為：基本培養(yǎng)基類型>椰子汁>IAA>6-BA。促進(jìn)白花擬萬代蘭植株生長的最佳培養(yǎng)配方處理為：KC+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+50 mL/L椰子汁，其平均葉片數(shù)量最多，達(dá)3.92（表5）。方差分析結(jié)果，基本培養(yǎng)基類型F值為19.996對白擬萬代蘭長葉影響顯著，椰子汁F值為8.341對白花擬萬代蘭長葉有一定的作用。

2.4不同基質(zhì)配比對白花擬萬代蘭移栽成活率的影響

煉苗移栽的試驗(yàn)結(jié)果（表6）表明，白花擬萬代蘭組培苗移栽成活率達(dá)92%以上。其中5個試驗(yàn)組合成活率達(dá)100%

（圖1-E、圖1-F），所選用的基質(zhì)對白花擬萬代蘭的栽培成活均表現(xiàn)出很好的效果，但在栽培試驗(yàn)過程中有一部分植株出現(xiàn)了爛根現(xiàn)象。根據(jù)各因素R值大小可知，4種因素對白花擬萬代蘭栽培成活率的影響強(qiáng)弱依次表現(xiàn)為泥炭土>木屑>苔蘚>珍珠巖。

方差分析結(jié)果（表7）表明，泥炭土F值為12.255、木屑F值為11.278，對白花擬萬代蘭假植成活率的影響顯著，苔蘚F值為6.654、珍珠巖F值為0.150，對白花擬萬代蘭假植成活率的影響不顯著。最優(yōu)的基質(zhì)體積配比為苔蘚 ∶[KG-*3]泥炭土 ∶[KG-*3]珍珠巖 ∶[KG-*3]木屑=1 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2 ∶[KG-*3]2。

3結(jié)論與討論

目前，國內(nèi)還沒有對白花擬萬代蘭的組培進(jìn)行系統(tǒng)的研究，對擬萬代蘭屬的相關(guān)研究也很少。本試驗(yàn)與常規(guī)的蘭花組織培養(yǎng)相比，將增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)同時進(jìn)行，所篩選的培養(yǎng)基配方對白花擬萬代蘭增殖和生根均有較好的效果，從而縮短了白花擬萬代蘭成苗的時間。白花擬萬代蘭為附生蘭，主要通過其特有的氣生根，從空氣中吸收水分和營養(yǎng)元素，或從根周圍的殘存物質(zhì)中吸收水分和營養(yǎng)，為適應(yīng)附生生活，減少水分損耗，它們一般都具有由莖的一部分膨大而形成的肉質(zhì)假鱗莖，葉片革質(zhì)[12]。附生蘭科植物不僅對附生環(huán)境要求嚴(yán)格，而且多數(shù)生長緩慢，每個生長軸1年中僅產(chǎn)生1個芽，需要較長的時間才能進(jìn)入成熟繁育期[13]。

基本培養(yǎng)基MS、1/2MS、VW、BS、KC及它們的改良型已經(jīng)普遍應(yīng)用于蘭花的組織培養(yǎng)中[14]。在蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)中，相關(guān)學(xué)者認(rèn)為，采用1/2MS基本培養(yǎng)基較適合蝴蝶蘭的生長[15]。激素對誘導(dǎo)植株再生和增殖有顯著的影響[16-17]，IAA能夠鈍化體細(xì)胞的形成，抑制體細(xì)胞胚的形成[18]，椰子汁含有多種營養(yǎng)和激素，經(jīng)過高壓滅菌后與蘭花組培培養(yǎng)基的其他活性物質(zhì)相容性高，能夠刺激愈傷組織或者原球莖的形成，提高細(xì)小片段外植體的存活率，調(diào)整蘭花花芽和類原球莖的分化過程[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基類型、IAA、椰子汁對白花擬萬代蘭叢生芽增殖的影響顯著。試驗(yàn)篩選出適宜叢生芽增值的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L +椰子汁250 mL/L。

有機(jī)物和天然物質(zhì)如椰子汁、土豆泥、香蕉勻漿等已經(jīng)被普遍用于蘭花組培中。在許多蘭花品種的培養(yǎng)基中加入有機(jī)添加劑（如椰子汁、土豆泥、香蕉勻漿）對蘭花生長增殖有促進(jìn)作用[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，椰子汁對叢生芽根長的影響顯著，與李正民等對蝴蝶蘭的研究結(jié)果[21]相似。試驗(yàn)篩選出適宜叢生芽生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L+椰子汁50 g/L。

白花擬萬代蘭的根為肉質(zhì)根，因而需要栽培基質(zhì)透水性好，且具有一定保水保肥能力，容易進(jìn)行滅菌處理，組培苗移栽還要根據(jù)蘭花的品種選用適宜的植料[22]。栽培試驗(yàn)過程中出現(xiàn)一部分植株?duì)€根現(xiàn)象，可能與栽培植料的持水性過高有關(guān)，與楊振華對蝴蝶蘭栽培基質(zhì)的研究[23]相似。試驗(yàn)結(jié)果表明，泥炭土、木屑對白花擬萬代蘭栽培成活率的影響顯著，最優(yōu)的基質(zhì)體積配比為：苔蘚 ∶[KG-*3]泥炭土 ∶[KG-*3]珍珠巖 ∶[KG-*3]木屑=1 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2 ∶[KG-*3]2。

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