丙酮醛降解酶基因的克隆與高效表達(dá)

王平++趙巧巧 +黃鷹

摘要：由于丙酮醛降解酶（methylglyoxal degradation enzyme，MD）是生物體內(nèi)代謝丙酮醛的一種關(guān)鍵酶，實(shí)現(xiàn)MD的高效表達(dá)對(duì)調(diào)控丙酮醛的代謝途徑具有重要意義。所以根據(jù)Schizosaccharomyces pombe_GeneDB中MD的基因序列（SPAC22E12.03C）設(shè)計(jì)引物，以粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）cDNA文庫為模板通過PCR擴(kuò)增技術(shù)得到目標(biāo)基因，目的片段全長(zhǎng)576 bp。將SPAC22E12.03C連接到pET-28a（+）上，得到重組質(zhì)粒pET-28a（+）-SPAC22E12.03C，并在Escherichia coli BL2l（DE3）中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。同時(shí)，對(duì)其目的蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得最佳表達(dá)條件：誘導(dǎo)溫度37 ℃，誘導(dǎo)起始菌體D600 nm為0.5～0.6，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.8 mmol/L。這為研究粟酒裂殖酵母體內(nèi)丙酮醛的降解途徑打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：粟酒裂殖酵母；丙酮醛降解酶；丙酮醛；基因克隆；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0062-04

[HJ1.4mm]

收稿日期：2015-03-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31070703） 。

作者簡(jiǎn)介：王平（1990—），女，河南南陽人，碩士研究生，從事粟酒裂殖酵母分子機(jī)理研究。E-mail：350479708@qq.com。

通信作者：黃鷹，教授，從事微生物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：paula_wong@163.com。[HJ]

丙酮醛（methylglyoxal）是在糖酵解、脂質(zhì)和氨基酸代謝過程中產(chǎn)生的一種對(duì)生物體有毒害作用的代謝物[1-2]，性質(zhì)活躍，屬于α-酮基醛類，由糖酵解的中間產(chǎn)物丙糖磷酸化裂解生成，或由丙酮和氨基丙酮代謝生成[3]。其醛基可與蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng)（又稱Maillard反應(yīng)）[4]形成一系列具有高度活性和高度異質(zhì)性的終產(chǎn)物，從而導(dǎo)致蛋白功能的修改和缺陷，Ward等研究證實(shí)，丙酮醛能通過細(xì)胞內(nèi)顆粒釋放而加強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)[5]，并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，包括胞吞、細(xì)胞因子釋放和細(xì)胞凋亡[6]等，丙酮醛在生物體內(nèi)過度累積會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；此外，丙酮醛與生物體的很多病變有關(guān)，如慢性糖尿病[7-8]、結(jié)腸癌和乳腺癌等。因此，丙酮醛在生物體內(nèi)的累積量必須受到嚴(yán)格的控制，丙酮醛降解酶是代謝丙酮醛的一種關(guān)鍵酶，于是對(duì)丙酮醛降解酶的研究顯得尤為重要。

近年來，各種慢性病患病率的增加，使得丙酮醛在體內(nèi)的代謝途徑受到越來越多的關(guān)注，丙酮醛代謝相關(guān)酶的研究也成為國際熱點(diǎn)。研究報(bào)道在細(xì)菌體內(nèi)丙酮醛的降解主要通過3條途徑：（1）依賴于谷胱甘肽的醛酮變位酶Ⅰ和醛酮變位酶Ⅱ[9]；（2）不依賴于谷胱甘肽的醛酮變位酶Ⅲ；（3）依賴于NADPH的醛還原酶和依賴于NADH的乙醇脫氫酶[10]。人體內(nèi)的DJ-1也具有分解丙酮醛的作用，我們以粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）為模式生物，通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和基因比對(duì)，找到了粟酒裂殖酵母體內(nèi)的能夠降解丙酮醛的酶，即SPAC22E12.03C的產(chǎn)物。

本試驗(yàn)根據(jù)SPAC22E12.03C的基因序列設(shè)計(jì)引物，以粟酒裂殖酵母的cDNA為模板通過PCR擴(kuò)增技術(shù)得到了目標(biāo)酶的基因，構(gòu)建T7強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)載體和重組工程菌株，研究丙酮醛降解酶的高效表達(dá)，希望以后能夠通過高效表達(dá)丙酮醛降解酶來調(diào)控和優(yōu)化丙酮醛的代謝途徑，從而為解決因丙酮醛在體內(nèi)累積過多引起的各種慢性疾病提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

本試驗(yàn)中所用的菌株名為Escherichia coli BL2l （DE3）、Escherichia coli top10，所用的質(zhì)粒為pET-28a（+），這些材料均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。粟酒裂殖酵母cDNA文庫來自美國，重組克隆pET-28a（+）-SPAC22E12.03C為筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2試劑及其來源

限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ、solutionⅠ[kite code.6022]、rTaq DNA 聚合酶、PrimeSTAR DNA聚合酶、蛋白marker、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG），均購自TaKaRa 公司；DNA 割膠回收試劑盒，來源于BioSpin Gel Extraction Kit；PCR過柱純化，來源于BioFLUX BioSpin PCR Purification Kit試劑盒；DNA marker 來源于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由南京思普金生物科技有限公司合成；卡那霉素（Kan）來源于Sigma 公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3粟酒裂殖酵母中目的片段SPAC22E12.03C的獲得

根據(jù)S.pombe_GeneDB數(shù)據(jù)庫中的丙酮醛降解酶基因（SPAC22E12.03C）序列設(shè)計(jì)上、下游引物，分別為SPAC22E12.03C-NcoⅠ-up：5′-CATG[ZZ（Z]CCATGG[ZZ）]TAAAGGTTTGCCTATTTGTTG-3′，SPAC22E12.03C-XhoⅠ-down：5′-CCG[ZZ（Z]CTCGAG[ZZ）]GGGCATACTAAGAGATTTATAGACA-3′ （下劃線分別為NcoⅠ和XhoⅠ酶切識(shí)別位點(diǎn)）。以粟酒裂殖酵母cDNA為模板擴(kuò)增丙酮醛降解酶基因，PCR反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 14.7 μL、5×PS buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L） 2 μL、cDNA模板1 μL、SPAC22E12.03C-NcoⅠ-up 1 μL、SPAC22E12.03C-XhoⅠ-down 1 μL、高保真DNA聚合酶 03 μL。[JP3]PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃ 變性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.4重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將上述PCR擴(kuò)增片段SPAC22E12.03C過柱純化后與質(zhì)粒pET-28a （+）雙酶切驗(yàn)證。酶切位點(diǎn)為NcoⅠ和XhoⅠ。將酶切產(chǎn)物回收得到目的DNA片段與質(zhì)粒pET-28a （+）酶切產(chǎn)物。接下來建立酶連體系為16.6 μL：SPAC22E12.03C目的片段8 μL、pET-28a （+）酶切產(chǎn)物0.3 μL、連接酶（SolutionⅠ） 8.3 μL。16 ℃ 連接4 h，將酶連產(chǎn)物導(dǎo)入到E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含Kan抗性的LB培養(yǎng)基上。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子提其質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將陽性質(zhì)粒送到南京斯普金科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒和pET-28a（+）空載質(zhì)粒分別通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，得到重組表達(dá)菌和帶有空載質(zhì)粒的對(duì)照菌。

1.5目的蛋白的表達(dá)

將得到的重組表達(dá)菌和帶有空載質(zhì)粒的對(duì)照菌分別接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，其中含有50 mg/L Kan。37 ℃ 220 r/min 恒溫?fù)u床過夜培養(yǎng)之后將重組表達(dá)菌和對(duì)照菌分別轉(zhuǎn)接至15 mL 同樣含50 mg/L Kan的LB培養(yǎng)基中，此時(shí)菌液D600 nm≈0.2，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)D600 nm達(dá)到0.6時(shí)，加入1 mmol/L IPTG，37 ℃ 220 r/min 培養(yǎng)過夜，次日，4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，收集菌體，用100 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH值為7.0）重懸菌體進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌3遍后加入適量的緩沖液（包含0.1 mmol/L PMSF和14.3 mmol/L的β-巰基乙醇）置于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，破碎10 s，冷卻10 s，待菌體破碎完全后，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，收集細(xì)胞上清，取適量進(jìn)行SDS-PAGE，分析目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)情況。

1.6目標(biāo)蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

優(yōu)化表達(dá)條件時(shí)分別選擇不同起始誘導(dǎo)菌濃度（D600 nm=0.307，D600 nm=0.455，D600 nm=0.557，D600 nm=0.603，D600 nm=0.805，D600 nm=1.117）與不同溫度（37、30、25、18 ℃）培養(yǎng)；培養(yǎng)基中添加不同終濃度的IPTG（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。通過SDS-PAGE 、總蛋白含量測(cè)定和酶活測(cè)定考察培養(yǎng)條件對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響。

1.7酶活測(cè)定

酶活測(cè)定根據(jù)丙酮醛降解酶在一定溫度條件下能降解丙酮醛，而丙酮醛可以與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成黃橙色的2，4-二硝基苯腙，苯腙在堿性條件下顯紫紅色，可在540 nm處檢測(cè)[11]。反應(yīng)體系是用100 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 值為7.0）配制成不同丙酮醛濃度的反應(yīng)液，總體積為200 μL，加入適量的丙酮醛降解酶，在45 ℃反應(yīng)一定時(shí)間，加入2，4-二硝基苯肼終止反應(yīng)，室溫下靜置15 min，再加入10%的NaOH，室溫放置15 min后用分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)定吸光度。酶活單位（U）定義為在該反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)催化降解0.1 μmol丙酮醛所需的酶量。

2結(jié)果與分析

2.1丙酮醛降解酶基因的克隆

以粟酒裂殖酵母cDNA為模板，以SPAC22E12.03C-NcoⅠ-up、 SPAC22E12.03C-XhoⅠ-down為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增獲得1條大于500 bp的DNA產(chǎn)物（圖1），與目的基因576 bp相吻合，過柱純化PCR產(chǎn)物，用NcoⅠ和XhoⅠ對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。

2.2表達(dá)載體pET-28a（+）-SPAC22E12.03C的構(gòu)建及驗(yàn)證

[CM（24]獲得丙酮醛降解酶基因并純化后，將其連接到pET-28a

（+）（NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切）得到pET-28a（+）-SPAC22E12.03C重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑選菌落，PCR驗(yàn)證有條帶的陽性重組子繼續(xù)培養(yǎng)，并提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，雙酶切后得到大小分別為500 bp和5 400 bp的條帶，基因片段大小正確。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序比對(duì)與S.pombe_Gene DB上公布的基因序列一致，證明丙酮醛降解酶基因已插入到pET-28a（+）載體中（圖2），成功構(gòu)建了pET-28a（+）-SPAC22E12.03C表達(dá)載體。將構(gòu)建成功的pET-28a（+）-SPAC22E12.03C 轉(zhuǎn)入到E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌。

[FK（W14][TPWP2.tif][FK）]

2.3重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

重組菌誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證（圖3），得到分子量大小約為20 ku的重組酶，與目的蛋白S.pombe_GeneDB上公布的21.08 ku相符，證明丙酮醛降解酶得到了表達(dá)。

[FK（W10][TPWP3.tif][FK）]

2.4丙酮醛降解酶的優(yōu)化表達(dá)

2.4.1溫度對(duì)丙酮醛降解酶可溶性表達(dá)的影響據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，溫度對(duì)目的蛋白的可溶性表達(dá)有很大的影響[12-13]。選定的條件為：在37、30、25、18 ℃，220 r/min 培養(yǎng)至D600 nm為0.8時(shí)，加入1 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)4 h。由SDS-PAGE（圖4和表1）分析可得，丙酮醛降解酶在37 ℃培養(yǎng)后上清中可溶蛋白的含量最多，相對(duì)沉淀中目的蛋白含量最少，酶活最高。可見37 ℃不僅是E. coli BL21的最適生長(zhǎng)溫度，并且在這個(gè)溫度下有活性的菌和帶外源基因的菌更多，從而表達(dá)的目的蛋白也多，且大部分以可溶形式存在，酶的活性也最高。

2.4.2IPTG對(duì)丙酮醛降解酶可溶性表達(dá)的影響在一定范圍內(nèi)，IPTG 濃度對(duì)重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)有一定影響[14]，降低表達(dá)水平可能提高某些目的蛋白的產(chǎn)量。因此，本試驗(yàn)選取了5個(gè)IPTG濃度，分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L。在 37 ℃ 220 r/min 培養(yǎng)D600 nm=0.6時(shí)，加入上述不同濃度的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h，分析IPTG濃度對(duì)丙酮醛降解酶可溶性表達(dá)的影響。表達(dá)載體pET28a（+）-SPAC22E12.03C含有T7/Lac 啟動(dòng)子，受IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)表達(dá)蛋白。當(dāng)IPTG濃度過低時(shí)，外源基因不能被完全表達(dá)，而高濃度的IPTG將對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用，由圖5和表2分析可知，IPTG濃度在0.6～1.0 mmol/L 時(shí)，總蛋白量略微升高，此范圍內(nèi)酶的活性也相對(duì)較高，但就三者目的蛋白的相對(duì)含量分析：0.6 mmol/L時(shí)相對(duì)含量為74.4%，0.8 mmol/L 時(shí)目的蛋白相對(duì)含量為77.9%，1.0 mmol/L時(shí)相對(duì)含量為73.3%，由蛋白相對(duì)含量和酶活大小分析可得，0.8 mmol/L時(shí)蛋白相對(duì)表達(dá)含量最高，酶的活性最高，因此選擇0.8 mmol/L作為誘導(dǎo)劑IPTG的最適濃度。

2.4.3誘導(dǎo)起始菌濃度不同對(duì)丙酮醛降解酶可溶性表達(dá)的影響據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，誘導(dǎo)起始菌濃度不同，菌體的生長(zhǎng)速率不同，外源蛋白表達(dá)水平會(huì)受到影響[15]。本試驗(yàn)選取了6個(gè)不同起始菌濃度：D600 nm=0.307，D600 nm=0.455，D600 nm=0.557，D600 nm=0.603，D600 nm=0.805，D600 nm=1.117，加入0.8 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h。由圖6和表3分析可知，隨著誘導(dǎo)起始菌濃度的增加，總蛋白水平在增加，目的蛋白的表達(dá)量也有

3結(jié)論

在前期研究基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)開展了對(duì)丙酮醛降解酶基因的克隆及其目的蛋白表達(dá)的研究。在對(duì)目的基因SPAC22E12.03C進(jìn)行克隆時(shí)，選取的驗(yàn)證酶切位點(diǎn)為NcoⅠ和XhoⅠ。接下來經(jīng)過酶聯(lián)與轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序，確定其為陽性質(zhì)粒。再次經(jīng)過轉(zhuǎn)化，成功得到重組表達(dá)菌和帶有空載質(zhì)粒的對(duì)照菌。

接下來本試驗(yàn)采取單因素控制變量法對(duì)目的蛋白最佳表達(dá)條件的進(jìn)行了探索。試驗(yàn)采用的3個(gè)變量分別為溫度、誘導(dǎo)劑IPTG、起始誘導(dǎo)菌濃度。檢測(cè)最佳條件的3個(gè)指標(biāo)為SDS-PAGE、總蛋白含量測(cè)定和酶活測(cè)定。結(jié)果表明，在培養(yǎng)溫度為37 ℃，IPTG濃度為0.8 mmol/L，誘導(dǎo)起始菌濃度的D600 nm在0.5～0.6時(shí)，結(jié)合酶活性分析，目的蛋白相對(duì)含量最高。通過對(duì)目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，為更好地揭示丙酮醛降解酶的作用機(jī)理提供了很好的平臺(tái)。

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