廣山藥組織培養技術的研究

張振霞++葉靜鵬++鄭莉++陳貴豪++鄭玉忠

摘要：以廣山藥塊莖為外植體進行組織培養，研究了消毒劑、消毒濃度、消毒時間對外植體消毒的影響，在此基礎上研究了不同激素配比、培養條件對外植體愈傷組織誘導、分化及生根的影響。試驗結果表明，用0.1%HgCl2 12 min的消毒條件處理山藥地下塊莖的效果較好；8 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA和5 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L 6-BA，誘導廣山藥塊莖愈傷組織的效果較好；采用1/2 MS+1 mg/L NAA+1 mg/L IBA的培養基對于廣山藥再生苗的生根效果最好，主根明顯，出現更多的不定根和毛狀根；添加1 g/L活性炭對于廣山藥塊莖褐化的防治效果明顯；黑暗培養能更好地誘導愈傷組織。

關鍵詞：廣山藥；組織培養；愈傷組織；激素；消毒

中圖分類號： S632.104+.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0076-05

收稿日期：2015-03-20

基金項目：韓山師范學院博士科研啟動項目（編號：QD20120626）。

作者簡介：張振霞（1975—），女，博士，副教授，從事植物生物技術研究。E-mail：zhangzhenxia2006@gmail.com。

通信作者：鄭玉忠，博士，副研究員，從事中藥學工作。E-mail：zhengyuzhong@gmail.com。 山藥是薯蕷 （Dioscorea opposita Thunb.） 的塊莖，早在宋代廣山藥就是中藥山藥的一個品種，在中醫上屬于補益類中藥，具有健脾止瀉、補肺益腎等功能；同時也是南方各地的傳統保健菜肴，營養豐富[1-2]。 山藥通常利用塊莖育苗或零余子播種等方式進行繁殖。這種傳統的繁殖方式有著一定的弊病，主要是因為多數薯蕷科種類的細胞核內染色體數目較多，容易發生變異，出現性狀分離，引起品種品質的退化[3]。另外，薯蕷科植物自身為了生存下來，會盡量多保留對外界環境適應能力強的性狀，例如零余子的增多，塊莖變小，品質變差，須根增多等[4]。此外，長期的無性繁殖會不斷積累病毒，使其生產力明顯下降[5-6]。目前對于山藥的培養研究多為懷山藥，而對廣山藥的組織培養少見報道。本研究利用植物生物技術中組織培養的方法對廣山藥進行快速無性繁殖，不僅可以保持其優良性狀，在短期內生產出大量整齊、均勻的健壯種苗，解決繁殖系數低、塊莖帶病毒等問題，從而滿足市場的大量要求。

1材料與方法

1.1材料來源

材料是購自廣東省汕頭市潮陽區的廣山藥塊莖，并種植于花盆中待其長出植株，選取其幼嫩葉片和塊莖作為試驗材料。

以MS、NB為基本培養基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂，pH值5.8，不同濃度2，4-D、NAA、6-BA、KT、IBA等激素。所有培養基均在121 ℃條件下高壓滅菌15 min。

培養室溫度（25±1） ℃，空氣相對濕度50%～60%，光照時間每天12 h，光照度1 000～1 500 lx 。

1.2方法與步驟

1.2.1廣山藥塊莖外植體的消毒選取新鮮廣山藥塊莖，用自來水清洗干凈后，放在蒸餾水中浸泡30 min，用蒸餾水清洗干凈，70%乙醇消毒10 s，再按不同的方式進行消毒處理（表1），加入消毒劑之后再加入2滴吐溫，恒溫搖床100 r/min振蕩滅菌，最后用無菌水清洗5次。用無菌濾紙吸干水分后將塊莖切成1 cm大小、厚度0.3 cm的塊狀接種到MS培養基中，觀察其生長狀態并記錄。

1.2.2廣山藥塊莖愈傷組織誘導培養基不同基本培養基對愈傷組織的誘導有著不同的影響，本試驗設置MS、1/2MS、NB母液培養基對廣山藥塊莖愈傷組織的誘導。以消毒后的廣山藥塊莖作為試驗外植體，均切1 cm大小、厚度0.3 cm的塊狀，接種至含5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA的MS、1/2MS、NB的培養基上，觀察并記錄基本培養基成分對廣山藥愈傷組織誘導的差異。

取消毒后的廣山藥塊莖接種到MS基本培養基上，其中不同的生長激素分別為1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA、1 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA、1 mg/L NAA+1 mg/L IBA、1 mg/L 2，4-D+1 mg/L IBA，觀察記錄廣山藥愈傷組織的生長狀況，比較哪種激素條件更適合誘導廣山藥塊莖愈傷組織的誘導。

將廣山藥的無菌塊莖接種在MS+0.5 mg/L 6-BA，設置2，4-D濃度分別為1、2、4、8、10 mg/L等5個不同濃度。通過觀察記錄，分析不同的2，4-D濃度對廣山藥塊莖愈傷組織生長的影響。

廣山藥塊莖均切小塊，接種在MS+5 mg/L 2，4-D，其中6-BA濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/L等5個不同處理。觀察記錄，分析不同的6-BA濃度對廣山藥塊莖愈傷組織生長的影響。

1.2.3廣山藥塊莖愈傷組織誘導的光照條件設置24 h、12 h 光照和黑暗培養3種光照條件，將廣山藥塊莖接種在 MS+5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA的培養基上，分別在上述的光照條件下培養。1個月后，觀察比較不同光照條件下廣山藥愈傷組織生長的差異。

1.2.4廣山藥愈傷組織防褐變處理取廣山藥的無菌塊莖接種到MS+5 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA，采用不同防褐化添加物：1 g/L PVP、2 g/L PVP、1 g/L 活性炭、2 g/L 活性炭，設置對照，觀察記錄5組試驗結果，并進行比較分析。

1.2.5誘導生根培養從試驗所得的廣山藥再生苗接種到不同培養基中（表2），觀察記錄再生苗生根的生長狀況，并統計生根率。

2結果與分析

2.1不同消毒方式對廣山藥塊莖外植體培養的影響

本試驗設置了不同種消毒方式，1周后比較染菌率及存活狀態，篩選適合廣山藥塊莖外植體的消毒方法。研究發現，不同的消毒條件，無論是哪種消毒劑、消毒濃度，消毒時間越長，污染率越低，壞死率越高（表3）。通過比較HgCl2的2個濃度0.05%和0.1%，以及次氯酸鈉的2個濃度20%和30%的消毒效果，選擇0.1%HgCl2消毒12 min作為廣山藥塊莖的消毒條件，在此條件下外植體污染率為8%，壞死率為34%，誘導率為58%。

2.2不同基本培養基對廣山藥塊莖愈傷組織誘導的影響

本試驗設置了MS、1/2MS、NB 的3種基本培養基，激素條件均為5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，來選擇誘導愈傷組織的最佳基本培養基。結果發現， 不同基本培養基成分對廣山藥愈傷組織的誘導效果不相同。廣山藥塊莖外植體在MS基本培養基中的出愈率最高，為78%；而1/2MS培養基中的出愈率僅有34%，且愈傷組織疏松，形狀不規則；NB與1/2MS 相比，其愈傷的外部形狀相似，出愈率相對高一些（表4）。由此可見，無機鹽含量高的MS基本成分更適合用于廣山藥愈傷組織的誘導培養生長，誘導的愈傷組織出愈率高，質地好，不會疏松，而且出根率、出芽率相對較低。

2.3不同生長激素配比對廣山藥塊莖愈傷組織誘導的影響

植物生長激素和細胞分裂素的配比決定植物組織培養過程中外植體的發育方向[6]，2，4-D、NAA、6-BA、IBA等都是使用廣范的植物激素。本試驗設置了4種不同組合來探究廣山藥塊莖誘導愈傷組織的情況，結果發現4種不同組合的生長激素對廣山藥塊莖愈傷組織的誘導都表現出較高的出愈率，分別能達到75%、73.75%、63.75%、58.75%，4種培養基的生根率、出芽率以及愈傷的生長狀況都不同（表5）。

2.4不同2，4-D濃度對廣山藥塊莖愈傷組織生長的影響

設置了5個不同的2，4-D濃度與0.5 mg/L 6-BA搭配來探究最適宜廣山藥塊莖誘導愈傷組織的2，4-D濃度，結果發現2，4-D濃度從1 mg/L到8 mg/L，隨著濃度的逐漸增大廣山藥外植體的出愈率也不斷升高，其中8 mg/L時出愈率高達100%，且愈傷顆粒狀、紫紅色。但當濃度增加到10 mg/L 時，出愈率反而比8 mg/L的出愈率下降了10百分點，同時外植體的愈傷生長速度變慢，愈傷質地更硬（圖1至圖5，表6）。根據以上分析可得出，在MS基本培養基上，8 mg/L 2，4-D 和0.5 mg/L 6-BA 時更適合于誘導廣山藥塊莖愈傷組織。

2.5不同6-BA濃度對廣山藥愈傷組織生長的影響

本試驗也同時選擇確定適合誘導愈傷組織的6-BA濃度。在2，4-D為5 mg/L的基礎上，設置5個6-BA的不同濃度梯度進行試驗。結果發現，6-BA 的濃度從0.1 mg/L到0.8 mg/L，隨著濃度的逐漸增加愈傷的出愈率也不斷升高，濃度為0.4 mg/L和 0.8 mg/L 時的出愈率均達到最高（95%），但當6-BA 的濃度增加到1 mg/L 時其出愈率反而下降了（表7）。由此可見，5 mg/L的 2，4-D+0.4 mg/L 6-BA組合誘導廣山藥愈傷組織比較理想。

2.6不同光照條件對廣山藥愈傷組織誘導的影響

光照條件也是植物組織培養中的影響因子，對愈傷組織誘導、培養組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響[6]。本試驗設置了24 h 光照培養、12 h光照培養、 黑暗培養3種

條件，來研究哪一種光照條件更適合廣山藥塊莖愈傷組織的培養。研究發現，3種光照條件對于淮山藥愈傷組織的誘導效果都不錯，其出愈率都達到85%以上，其中在黑暗培養的出愈率最高，為92%，愈傷的質量也是黑暗培養最好（表8）。由此可見，黑暗培養更適合誘導廣山藥塊莖愈傷組織的誘導生長。

2.7不同抗氧化措施對廣山藥塊莖褐變抑制的影響

廣山藥塊莖切塊培養過程中會出現褐化現象，影響了組織培養的成活率。本試驗采用PVP和活性炭來防止、減輕廣山藥塊莖褐變現象的發生。研究發現，添加各種防褐化材料對于廣山藥外植體誘導愈傷組織影響明顯，出愈率都達到90%以上；對比5組試驗的褐化率可以得出，活性炭的防褐化效果遠遠好于PVP，從外植體及愈傷組織的褐化變化過程中也可以得到同樣的結果（表9）。同時注意到活性炭的防褐化效果比較好，但濃度較高又會影響到外植體的存活率。

2.8誘導生根培養

在MS、1/2MS、1/2MS+1 mg/L IBA、1/2MS+1 mg/L NAA+1 mg/L IBA培養條件下，于廣山藥再生植株的誘導生根培養的效率均達到100%，只是誘導出來的根之間有一定的差別。MS培養基上生長的再生苗的根數量較少、纖細，毛狀根較少；1/2MS培養基上的根數量比前者多且粗壯；在1/2MS的基礎上添加1 mg/L IBA后，再生苗長出明顯的主根，并且又壯又長，還有少數的不定根；在1/2MS+1 mg/L NAA+1 mg/L IBA培養基上，長出來的根主根明顯，還有比較多的不定根，毛狀根也比較多，幼苗生長快（表10）。綜上所述，1/2MS+1 mg/L NAA+1 mg/L IBA培養基誘導再生苗生根比較理想（圖6）。

3結論與討論

3.1消毒劑的選擇以及消毒時間、消毒濃度的確定

選擇正確的消毒劑、消毒時間以及消毒濃度是建立組織培養體系的前提[6-7]。在試驗中選擇的消毒劑有HgCl2和次氯酸鈉，升汞的濃度分別為0.01%、0.02%、0.05%、0.1%，次氯酸鈉的濃度分別為20%、30%，消毒時間分別為5、8、12、15 min。不同的外植體設置有不同的消毒時間和消毒濃度。從消毒的結果可以發現，在一定范圍內，消毒劑濃度越低，消毒時間越短外植體污染率越高；消毒劑濃度越高，消毒時間越長，外植體的污染率越低，但是外植體的死亡率越高，這是因為有的外植體在消毒過程中死亡。在用乙醇處理過程中也要注意消毒時間，時間太長會造成外植體脫水死亡。此外，消毒過程中滴加適量的吐溫作為表面活性劑，并不斷振蕩搖晃，可以改善消毒效果。

3.2生長激素的選擇

在植物組織培養中配以適宜的植物激素是非常關鍵的，適當的生長調節劑對愈傷組織的誘導以及生根培養是極其重要的[7]。生長素與細胞分裂素的比例決定著發育的方向，比例高時，有利于根的形成和愈傷組織的形成；比例適中時，有利于根芽的分化；比例低時，有利于芽的形成[8]。豐鋒等[9]的報道也指出高濃度細胞分裂素有利于芽誘導增殖。本試驗中，廣山藥塊莖為外植體時選用高濃度的2，4-D和低濃度的6-BA有利于愈傷組織的生成，低濃度的2，4-D和高濃度的6-BA有利于根的生成。在生根培養中用了生長素NAA和IBA，對生根有很好的效果，其生根率都能達到 100 %，且主根明顯、粗壯。

3.3光照條件的選擇

光照條件對于植物生長是必不可少的條件，對于植物愈傷組織的誘導也是重要的條件之一[6]。試管苗或無菌苗的培養需要選用一定的光暗周期來進行組織培養，愈傷組織的誘導也需要一定的光暗周期，也有一些植物的愈傷組織在全黑暗的誘導下會長得更好。在試驗中設置有全日照培養、半日照培養和黑暗培養3種光照條件。研究發現，不管從出愈率還是愈傷組織的生長狀況來看，黑暗培養更加適合廣山藥塊莖愈傷組織的生長。

3.4褐化的防止

褐化是植物組織培養中一種常見的不利現象，對于外植體的脫分化和再分化過程的影響非常大，甚至是影響某些植物組織培養成功與否的關鍵[10]。影響外植體褐化的因素多種多樣，不同植物品種、同種植物的不同類型因為外植體材料的基因型不同，在組織培養中褐化發生的頻率和程度都存在著較大的差異[11]。防褐化的途徑也多種多樣，適宜的培養基、良好的培養條件、適宜的外植體或者增加抗褐化劑或吸附劑都可以有效地防止褐化現象。本試驗通過在培養基中增加抗褐劑和吸附劑活性炭和PVP來防止外植體的褐化。蔡建榮采用聚乙烯吡咯烷酮PVP來抑制淮山莖段和葉片外植體的褐化[12]。本研究結果顯示對于廣山藥塊莖，活性炭可以明顯吸附培養物分泌的酚、醌等有害物質，能有效降低褐變。

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