離子束誘變雙胚苗水稻的花器性狀及相關(guān)分析

黃雅琴++朱慶松+++李盡哲++黃群策

摘要：以離子束誘變所得同源四倍體雙胚苗突變水稻品系、近親系和介導(dǎo)后代為研究材料，對其花粉育性、花器性狀和花器性狀間相關(guān)性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，與四倍體雙胚苗品系相比，二倍體雙胚苗品系的正常花粉率、單穗結(jié)實(shí)率高，花器官偏小，花藥長對單穗結(jié)實(shí)率貢獻(xiàn)大，無芒率高，芒較短；披堿草介導(dǎo)品系的正常花粉率差異不顯著，花器官較大，柱頭長對單穗結(jié)實(shí)率貢獻(xiàn)最大，無芒率最低，芒較長；原始親本在各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)中都差異不顯著。

關(guān)鍵詞：離子束；雙胚苗；水稻；花粉育性；花器性狀；相關(guān)分析；芒

中圖分類號： S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0089-03

收稿日期：2015-02-06

基金項(xiàng)目：河南省科技前沿基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（編號：82300433202）。

作者簡介：黃雅琴（1986—），女，河南信陽人，碩士，講師，主要從事離子束生物效應(yīng)方面的研究。E-mail：hyaqin88@163.com。

通信作者：李盡哲，碩士，講師，主要從事生物技術(shù)方面的研究。E-mail：xynz1688@163.com。雜交水稻育種從研究方法上可以分為三系法、兩系法和一系法[1]。一系法雜交水稻研究的實(shí)質(zhì)就是挖掘無融合生殖種質(zhì)資源并建立特定的技術(shù)程序，以便固定水稻的雜種優(yōu)勢。前人的研究結(jié)果表明，在多倍體水平挖掘水稻潛在利用價(jià)值，從中篩選多胚苗材料，進(jìn)而尋找無融合生殖種質(zhì)是一條比較有效的途徑[2-4]。20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的離子束生物技術(shù)具有獨(dú)特的技術(shù)原理和簡單的操作程序，它在作物育種中的誘變效應(yīng)和介導(dǎo)作用已經(jīng)被證實(shí)[5]。筆者所在團(tuán)隊(duì)以低能氮離子束為誘變源對同源四倍體水稻進(jìn)行了誘變，在其后代群體中篩選到具有雙胚苗特征的新材料[6]。同源四倍體水稻具有特殊的生殖發(fā)育現(xiàn)象，在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程的不同階段出現(xiàn)異常現(xiàn)象造成花粉敗育[7]，有性繁殖器官花器結(jié)構(gòu)也不同于二倍體水稻[8]。本研究對1個(gè)同源四倍體雙胚苗突變水稻及其2個(gè)近親系、1個(gè)介導(dǎo)品系材料的花粉育性和花器性狀進(jìn)行研究，以同源四倍體雙胚苗水稻為材料開展無融合生殖種質(zhì)挖掘，以推進(jìn)一系法雜交水稻的選育進(jìn)程。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用材料為同源四倍體雙胚苗突變水稻材料D07-04-01，其近親系D07-02-01和01-04-01，及介導(dǎo)品系DP07-04-01。D07-02-01是以D07-04-01的花粉材料通過花藥培養(yǎng)途徑所獲得的穩(wěn)定二倍體株系；01-04-01是四倍體原始親本，由它通過離子注入后篩選到具有雙胚苗特征的D07-04-01；以D07-04-01為受體，披堿草總DNA為供體在離子束的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)基因，在后代群體內(nèi)篩選到四倍體突變單株DP07-04-01。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1I2-KI法觀察成熟花粉粒的育性在抽穗期，每份材料分別隨機(jī)挑選5個(gè)生長良好的未花幼穗，在每穗的上、中、下3個(gè)部位各取3朵穎花分別制成3個(gè)臨時(shí)裝片，用解剖針將每3朵穎花的18個(gè)花藥剝下放在1張載玻片上，滴1滴1%的I2-KI溶液，再用鑷子擠出花粉。在顯微鏡下放大100倍看 30個(gè)標(biāo)準(zhǔn)視野，對成熟花粉粒的育性情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。根據(jù)I2-KI染色后花粉的表現(xiàn)形態(tài)可分為典敗、圓敗、染敗、正常4種。典敗花粉粒形態(tài)不規(guī)則、透明不染色；圓敗花粉粒圓形，透明不染色；染敗花粉粒圓形，不透明或部分透明，輕度染色；正常花粉粒圓形，不透明，染成較均勻的棕黑色。

1.2.2花器性狀的研究在抽穗期，每份材料分別隨機(jī)挑選30個(gè)生長良好的未花幼穗，在每穗上、中、下3個(gè)部位各取3朵穎花，用游標(biāo)卡尺測量穎花長（x1）、穎花寬（x2），長、寬均測量穎花最長最寬處，精確至0.02 mm，重復(fù)3 次。用圖像掃描法測量柱頭長（x4）、柱頭寬（x6）、子房高（x7）、子房寬（x8）、花藥長（x9）和花藥寬（x10）（單位均為mm） 。計(jì)算2個(gè)2級數(shù)據(jù)：穎花長寬比（x3）；x4+花柱長=花柱長（x5）。

單穗結(jié)實(shí)率（y）：成熟期，每份材料隨機(jī)取生長發(fā)育良好的單穗30個(gè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)數(shù)，單穗結(jié)實(shí)率=（單穗的結(jié)實(shí)數(shù)/總穎花數(shù)）×100%。用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行兩組平均數(shù)t檢驗(yàn)，并分析各性狀的差異顯著性；為了比較不同花器性狀對單穗結(jié)實(shí)率的貢獻(xiàn)大小，以單穗結(jié)實(shí)率為依變量，其余10個(gè)花器性狀（x1～x10）為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，分析花器性狀間的相關(guān)性。

隨機(jī)選取1 000粒稻谷進(jìn)行芒長的測定，并根據(jù)所得數(shù)據(jù)實(shí)際情況將其分成10組，計(jì)算每1組的概率。每組的組距為5 mm，組限為0～5 mm、5～10 mm、……、45～50 mm，如芒長恰為5的整數(shù)倍，則將其歸入比其小的組限。

2結(jié)果與分析

2.1花粉育性的比較

同源四倍體水稻與普通的二倍體水稻相比，在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，出現(xiàn)了各種不正常分裂的情況，發(fā)生于單核小孢子期的敗育表現(xiàn)為典敗，發(fā)生于二胞花粉早期的敗育表現(xiàn)為圓敗，發(fā)生于二胞花粉晚期或三胞花粉早期的敗育表現(xiàn)為染敗，這些都最終導(dǎo)致了花粉敗育，因而四倍體水稻的結(jié)實(shí)率要比二倍體水稻低。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，與D07-04-01相比，D07-02-01的典敗、圓敗、染敗分別少3.26百分點(diǎn)、8.41百分點(diǎn)、24.47百分點(diǎn)，正常高出36.14百分點(diǎn)；01-04-01的典敗和正常分別高出6.31百分點(diǎn)、10.82百分點(diǎn)，圓敗和染敗少5.57百分點(diǎn)和11.57百分點(diǎn)；DP07-04-01的典敗、圓敗、正常分別高出1.51百分點(diǎn)、5.01百分點(diǎn)、3.18百分點(diǎn)，染敗少9.7百分點(diǎn)。由此可見，D07-02-01的正常花粉率最高，D07-04-01、01-04-01和DP07-04-01的敗育類型均主要為染敗。

2.2花器性狀的比較

由表2可知，在花器性狀方面，同D07-04-01相比，D07-02-01與其差異顯著或極顯著，其次是DP07-04-01，01-04-01與其差異最小。D07-02-01在研究的11個(gè)花器性狀中，與D07-04-01差異達(dá)極顯著水平的有穎花長、穎花寬、柱頭長、花柱長+柱頭長、柱頭寬、子房高、子房寬、花藥長、花藥寬和單穗結(jié)實(shí)率共10個(gè)參數(shù)，其中僅單穗結(jié)實(shí)率高出50.33百分點(diǎn)，其他均低；穎花長寬比達(dá)顯著差異（P<0.05），少了6.62%，僅為2.96。DP07-04-01的11個(gè)花器性狀中僅柱頭寬達(dá)到極顯著差異，高出16.48百分點(diǎn)；達(dá)到差異顯著水平的有柱頭長和子房寬，分別高出6.67百分點(diǎn)、7.69百分點(diǎn)；其他參數(shù)均未達(dá)到差異顯著性水平。01-04-01 的11個(gè)花器性狀均未達(dá)到差異顯著性水平，其中花柱長+柱頭長、子房高、子房寬、花藥寬、穎花長和穎花寬共6個(gè)參數(shù)低于對照，減少最多的是花藥寬，高達(dá)6.12%；柱頭長、柱頭寬、花藥長、穎花長寬比和單穗結(jié)實(shí)率、共5個(gè)參數(shù)高于對照，增加最多的是柱頭長，達(dá)4.44%。

由以上分析可見，在花器性狀上，二倍體雙胚苗材料與四倍體雙胚苗材料之間的差異十分顯著，可見染色體數(shù)目的差異能造成花器性狀的顯著差異；披堿草介導(dǎo)品系由于獲得了披堿草的部分優(yōu)良特性，抗逆能力強(qiáng)，花器性狀參數(shù)增大，柱頭寬大，更容易接受花粉而受孕。

2.3花器性狀間的相關(guān)分析

D07-04-01的逐步回歸方程為：

y=0.024 9-0.005 2x2+0.003 3x5-0.007 1x8+0.000 7x9+38.956 2x10（R=0.938 2**，SSE=0.001 1）。

由方程可知，單穗結(jié)實(shí)率與穎花寬、柱頭長+花柱長、子房寬、花藥長、花藥寬相關(guān)，其中與柱頭長+花柱長、花藥長、花藥寬呈正相關(guān)，與穎花寬、子房寬呈負(fù)相關(guān)。單穗結(jié)實(shí)率與

柱頭長+花柱長、花藥長、花藥寬的偏相關(guān)系數(shù)分別為0.584 1*、0.861 2**、0.830 3**。由此可見，對單穗結(jié)實(shí)率的貢獻(xiàn)上，花藥長>花藥寬>柱頭長+花柱長。

D07-02-01的逐步回歸方程為：

y=-0.013 9+0.003 6x4+0.007 2x6-0.002 2x8+28.764 8x9（R=0.924 3**，SSE=0.000 8）。

由方程可知，單穗結(jié)實(shí)率與柱頭長、柱頭寬、子房寬、花藥長相關(guān)，其中與柱頭長、柱頭寬、花藥長呈正相關(guān)，與子房寬呈負(fù)相關(guān)。單穗結(jié)實(shí)率與柱頭長、柱頭寬、花藥長的偏相關(guān)系數(shù)分別為0.554 6、0.659 6*、0.692 1*。通過比較偏相關(guān)系數(shù)大小可知，對單穗結(jié)實(shí)率的貢獻(xiàn)上，花藥長>柱頭寬>柱頭長。

01-04-01的逐步回歸方程為：

y=0.021 5-0.005 7x3+0.001 4x5+0.012 9x6+40.560 1x9（R=0.957 4*，SSE=0.000 5）。

由方程可知，單穗結(jié)實(shí)率與穎花長寬比、柱頭長+花柱長、柱頭寬、花藥長相關(guān)，其中與柱頭長+花柱長、柱頭寬、花藥長呈正相關(guān)，與穎花長寬比呈負(fù)相關(guān)。單穗結(jié)實(shí)率與柱頭長+花柱長、柱頭寬、花藥長的偏相關(guān)系數(shù)分別為0.786 3**、0.742 2*、0.624 5。由此可見，對單穗結(jié)實(shí)率的貢獻(xiàn)上，柱頭長+花柱長>柱頭寬>花藥長。

DP07-04-01的逐步回歸方程為：

y=-0.014 7-0.001 3x3+0.009 3x4-0.005 2x8+0.001 1x9+44.783 4x10（R=0.968 4**，SSE=0.001 0）。

由方程可知，單穗結(jié)實(shí)率與穎花長寬比、柱頭長、子房寬、花藥長、花藥寬相關(guān)，其中與柱頭長、花藥長、花藥寬呈正相關(guān)，與穎花長寬比、子房寬呈負(fù)相關(guān)。單穗結(jié)實(shí)率與柱頭長、花藥長、花藥寬的偏相關(guān)系數(shù)分別為0.8053**、0.7841**、0.6522。由此可見，對單穗結(jié)實(shí)率的貢獻(xiàn)上，柱頭長>花藥長>花藥寬。

2.4芒的特征比較

觀察每份材料的稻谷后發(fā)現(xiàn)并非每粒都有芒，因此它們都屬于“部分有芒型”，有芒的稻谷，芒的長度也大小不一。D07-04-01無芒率為15.79%，有芒率為84.21%，芒長變幅在0.5～28.8 mm；D07-02-01無芒率為67.96%，有芒率為32.04%，芒長變幅在0.5～11.3 mm；01-04-01無芒率為18.74%，有芒率為81.26%，芒長變幅在0.5～26.3 mm；DP07-04-01無芒率為13.45%，有芒率為86.55%，芒長變幅在0.5～29.3 mm。芒長概率分布如圖1所示，它們的概率密度都整體呈下降趨勢，概率密度最大的都是（0～5 mm）這一組，分別為0.394 5、0.789 5、0.402 0和0.362 7，可見芒長≤5 mm的最多。值得注意的是，唯一的一個(gè)二倍體雙胚苗水稻品系D07-02-01，它的芒長最大為11.3 mm，因此，15～20 mm、20～25 mm、25～30 mm這3個(gè)組限的概率均為零。從整個(gè)稻穗上考察不同長度芒的分布，4個(gè)雙胚苗系列材料都具有這樣的特點(diǎn)，即枝梗頂端上部穎花的芒較長，數(shù)量少；枝梗下部穎花芒較短，甚至無芒。由此可見，染色體組減半后，無芒率明顯上升，并且芒長縮短，這是有利變異，有利于稻谷的收割和加工。

3結(jié)論與討論

離子束生物工程是20世紀(jì)80年代在我國興起的，其原理是利用低能離子束注入生物體，質(zhì)量沉積、能量沉積和電荷交換導(dǎo)致生物材料產(chǎn)生一定的生物學(xué)效應(yīng)。離子束生物技術(shù)發(fā)展起來后，在農(nóng)作物育種和遺傳改良上得以廣泛應(yīng)用。我們利用低能氮離子束對同源四倍體水稻進(jìn)行注入處理，從其后代群體內(nèi)中篩選到具有雙胚苗遺傳特性的突變株，通過對D07-04-01、D07-02-01、01-04-01和DP07-04-01這4個(gè)雙胚苗系列材料的花粉育性、花器性狀和芒長分布進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)二倍體雙胚苗品系D07-02-01的正常花粉率最高、花器官偏小、單穗結(jié)實(shí)率最高、花藥長對單穗結(jié)實(shí)率貢獻(xiàn)最大、無芒率最高、芒較短；DP07-04-01這一披堿草介導(dǎo)品系的花器官較大、柱頭長對單穗結(jié)實(shí)率貢獻(xiàn)最大、無芒率最低、芒較長；01-04-01這一原始親本與D07-04-01在各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)中都差異不明顯。已進(jìn)行的苗位和胚位研究發(fā)現(xiàn)，D07-02-01的苗位、胚位類型豐富，多胚率高[9]。通過掃描電鏡的觀察發(fā)現(xiàn)D07-02-01的堊白粒率、堊白度和堊白大小均最小，稻米的自然橫斷面中部無明顯輻射狀，裂痕少且淺，“粗短形”的不規(guī)則多邊形胚乳細(xì)胞與淀粉粒分布均勻，多面體狀淀粉粒呈現(xiàn)典型的晶體結(jié)構(gòu)，數(shù)目多且排列致密，球形單粒淀粉粒和塊狀不規(guī)則的復(fù)粒淀粉體數(shù)目比較少，相對結(jié)晶度高，直鏈淀粉含量低[10]。綜合以上研究認(rèn)為，二倍體雙胚苗品系D07-02-01雙胚苗頻率高，結(jié)實(shí)率高，加工品質(zhì)優(yōu)良，具有進(jìn)一步挖掘無融合生殖資源的潛在價(jià)值，值得進(jìn)一步研究開發(fā)。

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