甜高粱的糖分積累與蔗糖合成酶基因表達規律的相關性

夏卜賢+++安云蓉+++高建明+++羅峰+++陳曉木++李歐靜++王飛揚+++石東峰+++關小楠+++吳宏玉+++裴忠有

摘要：以甜高粱品種羅馬和W452與普通高粱品種忻粱52不同生育時期的葉片和莖稈為材料，對總糖、蔗糖含量以及蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）基因表達規律進行研究。結果表明：在葉片和莖稈的整個生育期，蔗糖為總糖的主要組成成分，其含量與總糖含量的變化趨勢一致；在葉片中，總糖和蔗糖含量從拔節期開始逐漸升高，在灌漿期達到最高，隨后又下降，同時通過對SS基因表達規律研究發現，SS基因表達量先于蔗糖含量在開花期達到最高；在莖稈中，蔗糖含量占總糖含量的60%，甜高粱的糖分含量明顯高于普通高粱，完熟期時糖分含量達到最高，而SS基因表達規律與在葉片中表達相似，開花期達到最高，隨后有所下降。因此，通過研究糖分含量變化趨勢與SS基因表達規律為甜高粱分子育種創造了條件。

關鍵詞：甜高粱；qRT-PCR；糖分積累；蔗糖合成酶；基因表達；生育期

中圖分類號： S514.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0133-03

收稿日期：2015-01-05

基金項目：天津市中青年骨干創新人才培養計劃；天津市科技支撐計劃（編號：12ZCZDNC00100）；天津市高校優秀青年教師資助。

作者簡介：夏卜賢（1989—），男，安徽馬鞍山人，碩士研究生，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：beifanglang12689@126.com。

通信作者：裴忠有（1967—），男，遼寧大連人，博士，研究員，主要從事甜高粱育種研究。E-mail：zhongyoupei@tjau.edu.cn。隨著化石能源的日趨枯竭和環境的日益惡化，發展生物能源成為未來解決能源危機的主要途徑。甜高粱作為普通高粱的一個變種，因其莖稈糖分、汁液含量高，是目前被公認最有發展前景的能源作物之一，而其總糖、蔗糖含量以及蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）基因調節蔗糖合成代謝已成為研究熱點。謝鳳周對甜高粱品種麗歐的總糖含量變化趨勢進行了研究，發現在整個生育時期呈逐漸增加的趨勢，在完熟期達到最高[1]；楊相坤等對蔗糖含量在整個生育時期的變化進行了研究，發現從孕穗期到蠟熟期呈逐漸升高、在蠟熟期達到最高值后又略有下降趨勢[2-3]。通過對甜高粱莖稈汁液化學成分的分析發現，蔗糖是其主要成分，占55%左右[4]。而蔗糖受作為調節植物蔗糖代謝的關鍵酶之一SS的調節，該酶在小麥胚芽中被首次發現[5-7]，它參與淀粉、纖維素和ATP 等的合成，調動蔗糖進入各種代謝途徑，且可逆合成和分解蔗糖，進而調節植物的生長過程等[8]；該酶在番茄中控制蔗糖的合成及運轉，保持相對較強的活性[9]；該酶在甘蔗中有利于運輸過程中將庫器官的蔗糖卸出[10]，在多數植物中存在2種同工酶SS1和SS2，其中SS1主要分解蔗糖，SS2主要合成蔗糖[11]，并且利用酶聯免疫法（ELISA）驗證了蔗糖合成酶表達量與蔗糖含量具有顯著的相關性[12]。本研究測定了普通高粱及甜高粱的葉片和莖稈中糖分含量，分析了SS基因的表達量，這對進一步了解葉片、莖稈中的糖分積累與SS基因表達之間的關系具有非常重要的意義。

1材料與方法

1.1材料種植及取樣

本試驗所用甜高粱品種為羅馬和W452，普通高粱品種為忻粱52，均由天津農學院高粱育種課題組提供。試驗分別于2011年和2012年在天津農學院作物標本園進行，試驗地前茬為玉米，土壤肥力偏低。5月1日播種，設3次重復，每個小區面積30 m2，行長4 m，行距0.5 m，株距0.2 m；播種時每個小區施底肥硫酸鉀和復合肥各0.075 kg；中耕除草3次。分別在拔節期、孕穗期、抽穗期、開花期、灌漿期和完熟期等6個生育時期隨機重復3次取樣，取材部位為植株中部莖稈和完全展開的葉片，一部分用于測定樣品的各種糖分含量，另一部分用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱內保存，用于研究葉片及莖稈中蔗糖合成酶基因的表達規律。

1.2試劑

測量總糖含量所用試劑包括酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa·4H2O）、硫酸銅（CuSO4·5H2O）、無水葡萄糖（C6H12O6）、氫氧化鈉（NaOH）、亞鐵氰化鉀[K4F4（CN）6·3H2O]、次甲基藍（C16H18CIN3S·3H2O）、鹽酸（HCl），均購自天津北方天醫化學試劑廠。測量蔗糖含量所用試劑包括色譜純乙腈、果糖標準品、葡萄糖標準品、蔗糖標準品，均購于中國藥品生物制品檢定所。RNA提取試劑盒購自北京百泰克（Bioteke）公司。反轉錄試劑盒購于北京康為世紀公司，定量反應中的內參基因β-actin及SS基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3蔗糖和總糖含量的測定

高粱莖稈和葉片通過榨汁處理后分成2份，分別用于總糖和蔗糖含量的測定，簡單步驟為：向10 mL樣品中加入1 mL 濃硫酸，混勻，68 ℃水解10 min，隨后使用SGD-Ⅳ型全自動還原糖測定儀測定汁液中的總糖含量，采用高效液相色譜儀（安捷倫CP-3800）測定樣品中的蔗糖含量，每個樣品重復測定3次。

1.4總RNA的提取與分析

根據百泰克公司RNA提取試劑盒的說明提取高粱葉片和莖稈的總RNA。將提取的RNA溶于溶解液（TE Buffer）后，使用微量核酸測定儀檢測其純度和濃度，并取1 μL的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，以確定所提取RNA的完整性。

1.5利用qRT-PCR分析蔗糖合成酶基因的表達

本試驗應用Primer 5、Oligo 6 等軟件在甜高粱SS基因Susy2（FJ513325）跨內含子區設計正向引物5′-GTCCCTCAAGACACTCCCT-3′和反向引物5′-ATTGGATTGGGCAAAGTAG-3′；高粱β-actin基因引物，其正向序列為5′-ACGGCCTGGATGGCGACGTACATG-3′，反向序列為5′-GCAGAAGGACGCCTACGTTGTGTAC-3′。按北京康為世紀公司反轉錄試劑盒的說明將RNA樣品反轉成cDNAs。cDNAs合成后，將cDNA以10倍梯度稀釋成5個濃度，使用ABI公司的7 500 fast熒光定量PCR儀分別擴增靶基因SS和內參基因β-actin，根據2個基因的循環數與初始模板濃度制備2個基因的標準曲線，并進行擴增效率的檢測。擴增體系如下：cDNAs 2 μL，依次加入12.5 μL的2×Ultra SYBR Mixture，10 μmol/L上下游引物各1 μL，最后加入RNase-Free的水補至25 μL。實時熒光定量PCR的擴增程序如下：預變性95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。溶解曲線程序為：95 ℃15 s；60 ℃1 min；95 ℃15 s；60 ℃15 s。每個樣本進行3次重復，同時設置無模板陰性作對照。在反應結束后儀器會自動生成熔解曲線圖及樣品的循環數（CT）。

2結果與分析

2.1不同生育時期葉片中總糖和蔗糖含量的變化

為了解作為糖分合成部位——葉片中糖分的變化情況，本試驗對甜高粱品種羅馬和W452與普通高粱品種忻粱52不同生育時期總糖和蔗糖含量進行測定。由圖1、圖2可以看出，3個品種糖分含量都呈現出從拔節期至灌漿期一直上升而到完熟期又有所下降的趨勢，3個品種葉片中的糖分含量在開花期和灌漿期比較接近；從整個生育時期來看，3個品種的糖分含量在灌漿期都有1個突然升高的過程，可能這一時期是糖分合成的活躍期，等到完熟期時，大量糖分被運輸至莖稈或穗子中，所以此時又呈下降趨勢。

2.2不同生育時期莖稈中總糖和蔗糖含量的變化

甜高粱為普通高粱的一個變種，它的莖稈已經成為糖分儲存的庫，而普通高粱的莖稈只是作為糖分轉移的流。從圖3、圖4可以看出，W452和忻粱52總糖和蔗糖含量從拔節期開始逐漸升高，灌漿期時達到最高值，隨后在完熟期又有所下降；而羅馬的總糖和蔗糖含量則在完熟期達到最高值，這種變化趨勢與葉片中的糖分積累規律基本一致，同樣甜高粱莖稈中的糖分在灌漿期也有1個突然升高的過程，但忻粱52莖稈中的總糖和蔗糖含量與甜高粱相比在各個時期都比較低，這可能是因為灌漿期時葉片中大量合成的蔗糖流向庫器官——

穗，很少在莖稈中儲存，導致莖稈中的糖分含量比較低，而甜高粱的庫器官除了穗以外還有莖稈，因此甜高粱莖稈中總糖和蔗糖含量明顯高于普通高粱莖稈；同時本試驗還在3個品種中進行蔗糖和總糖含量的相關性分析，結果表明，不同高粱品種莖稈內的蔗糖和總糖含量都呈現出極顯著相關（r>0.98，P<0.01），蔗糖含量約占總糖含量的60%。

2.3不同生育時期葉片中SS基因表達分析

SS基因是植物蔗糖合成重要的調節基因，本試驗利用qRT-PCR方法對3個高粱品種羅馬、W452與忻粱52的不同生育時期葉片中的SS基因表達進行分析。從圖5可以看出，以拔節期的表達量作為參照，SS基因在不同高粱品種中的表達量均呈現先升后降的趨勢，開花期達到最高，此時羅馬、W452和忻粱52的表達量分別是拔節期的7.8、10.5、1.8倍，可見2個甜高粱品種變化幅度較忻粱52明顯，忻粱52葉片中SS基因在不同生育時期的表達量變化差異不大。

2.4不同生育時期莖稈中SS基因表達分析

莖稈為甜高粱糖分的主要儲藏器官，了解莖稈中SS基因的表達與甜高粱中蔗糖積累的關系具有非常重要的意義。本試驗對羅馬、W452和忻粱52的各個時期莖稈中SS基因的表達量進行分析（圖6）。在整個生育時期，SS基因在3個品種內的表達量均呈現先升后降的趨勢，至開花期表達量最高，此時羅馬、W452和忻粱52的表達量分別為拔節期的5.0、5.1、1.7倍，說明SS基因在甜高粱品種中的表達量明顯比普通高粱高，而且SS基因在忻粱52各個生育期中的表達量變化差異不大，該結果與葉片中SS基因的表達量變化趨勢一致，但是表達量明顯比葉片中的少。

2.5高粱SS基因表達與蔗糖含量的相關性分析

通過以上蔗糖和SS基因在葉片和莖稈整個生育時期的變化趨勢可以看出，SS基因的變化趨勢與蔗糖含量的變化趨勢基本表現一致，但SS基因表達量的最高峰是在開花期，蔗糖含量最高峰出現在灌漿期，主要因為開花期蔗糖合成活躍，但開花這一生理過程會消耗植物大量的能量[13]，以致流向庫器官中的蔗糖少，所以在灌漿期之前蔗糖積累緩慢；到了灌漿期，雖然SS基因的表達量有所下降，但高粱生長發育的幾大耗能過程已結束，此時合成的蔗糖開始積累，導致葉片和莖稈中的蔗糖含量在灌漿期有1個短暫快速的積累過程。因此，總的來說SS基因的表達與蔗糖積累具有一定的相關關系。

3結論與討論

高粱為重要的能源和飼料作物，已為世界各國所認同[14]。甜高粱莖稈無論是用來生產燃料乙醇還是用作青貯飼料，了解其糖分組成及決定因素對提高糖分含量具有重要意義。結果表明，蔗糖是甜高粱糖分的主要成分，而先前對蔗糖含量的相關性研究大都基于酶活性的測定，酶活性分析容易受提取過程和外界因素的影響，不一定能完全反映兩者之間的關系[15]。本試驗通過對不同高粱品種葉片和莖稈中糖分含量的測定與SS基因表達量的比較，獲得更直接的與糖分積累相關的數據。

從生理上來說，葉片是高粱的源器官，蔗糖在葉片中合成后經長距離運輸到庫器官。本研究結果表明，葉片中總糖和蔗糖含量的變化呈“山峰”的變化趨勢，灌漿期時糖分含量達到最高值，但是通過對SS基因表達規律的研究發現，SS基因表達量先于蔗糖含量在開花期達到最高，即糖分含量的積累具有一定的延后性。

普通高粱的穗是其唯一的“庫”，而甜高粱作為普通高粱的變種具有2個庫器官——穗和莖稈。相較于普通高粱而言，甜高粱莖稈中總糖和蔗糖的積累明顯提高，完熟期時糖分含量達到最高值，而SS基因的表達規律與在葉片中相似，開花期表達量達到最高值，隨后有所下降。甜高粱莖稈在開花期之前蔗糖含量普遍較低，并且不同品種的差異并不大，從灌漿期開始，蔗糖大量積累，到完熟期時甜高粱莖稈中蔗糖含量高于普通高粱忻粱52將近6倍，這與陳維維等的研究結論[16-17]相似。但從2個甜高粱品種整個生育時期莖稈中糖分含量的變化來看，W452從拔節期到開花期呈上升趨勢，灌漿期達到最大值后略有下降，這一結果與張華文等的研究結論[18]一致，而羅馬直到完熟期時才達到最大值，其結果與麗歐品種的特性[1]相似，這可能是因為羅馬（生育期為190 d）的生育期比W452（132 d）長的原因，測定羅馬完熟期糖分時已是深秋，低溫條件降低了細胞的呼吸強度，使得糖分一直處于不斷積累的過程。

從拔節期開始，SS基因的表達量一直呈緩慢上升的趨勢，到開花期突然增高，此時合成的大量蔗糖主要供給開花過程[13]，隨著這一耗能過程的結束，光合產物開始往儲藏器官中運輸。雖然隨后SS基因的表達量有所下降，但此時甜高粱莖稈中的蔗糖含量積累速度仍然大于消耗速度，這也正是在生長后期糖分不斷積累的原因。本試驗結果表明，SS基因很可能是影響糖分差異的主要基因，說明在以后育種上可以根據SS基因的表達量為指標篩選獲得優質的甜高粱品種。

參考文獻：

[1]謝鳳周. 糖高粱莖稈糖分積累規律初步研究[J]. 遼寧農業科學，1989（5）：50-51.

[2]楊相昆，田海燕，陳樹賓，等. 不同種植密度對甜高粱糖分積累的影響[J]. 西南農業學報，2009，22（1）：60-63.

[3]Lingle S E. Sucrose metabolism in the primary culm of sweet sorghum during development[J]. Crop Science，1987，27（6）：1214-1219.

[4]Billa E，Koullas D P，Monties B，et al. Structure and composition of sweet sorghum stalk components[J]. Industrial Crops and Products，1997，6（3/4）：297-302.

[5]黃東亮，李雙喜，廖青，等. 植物蔗糖磷酸合成酶研究進展[J]. 中國生物工程雜志，2012，32（6）：109-119.

[6]Sturm A，ebková V，Lorenz K，et al. Development-and organ-specific expression of the genes for sucrose synthase and three isoenzymes of acid β-fructofuranosidase in carrot[J]. Planta，1995，195（4）：601-610.

[7]Cardini C E，Leloir L F，Chiriboga J. The biosynthesis of sucrose[J]. J Biol Chem，1955，214：149-155.

[8]盧合全，沈法富，劉凌霄，等. 植物蔗糖合成酶功能與分子生物學研究進展[J]. 中國農學通報，2005，21（7）：34-37，57.

[9]齊紅巖，李天來，劉海濤，等. 番茄不同部位中糖含量和相關酶活性的研究[J]. 園藝學報，2005，32（2）：239-243.

[10]Martin T，Frommer W B，Salanoubat M，et al. Expression of an arabidopsis sucrose synthase gene indicates a role in metabolization of sucrose both during phloem loading and in sink organs[J]. The Plant Journal for Cell and Molecular Biology，1993，4（2）：367-377.

[11]Komatsu A，Moriguchi T，Koyama K，et al. Analysis of sucrose synthase genes in citrus suggests different roles and phylogenetic relationships[J]. Journal of Experimental Botany，2002，53（366）：61-71.

[12]楊明，劉麗娟，李莉云，等. 甜高粱蔗糖合酶表達與蔗糖積累的相關分析[J]. 作物學報，2009，35（1）：185-189.

[13]Kawano S，Nagai Y. The productive and reproductive biology of flowering plants[J]. Journal of Plant Research，1975，88（4）：281-318.

[14]詹秋文. 高粱與蘇丹草的遺傳及其雜種優勢利用的研究[D]. 南京：南京農業大學，2007：1-2.

[15]劉鵬，胡昌浩，董樹亭，等. 甜質型與普通型玉米籽粒發育過程中糖代謝相關酶活性的比較[J]. 中國農業科學，2005，38（1）：52-58.

[16]陳維維，再吐尼古麗·庫爾班，涂振東，等. 不同種植密度對甜高粱糖分積累及SS、SPS活性的影響[J]. 作物學報，2013，39（8）：1507-1513.

[17]聶元冬，鐘海麗，頓寶慶，等. 甜高粱SAI基因的表達與莖稈糖分積累的相關性分析[J]. 中國農業科學，2013，46（21）：4506-4514.

[18]張華文，秦嶺，王海蓮，等. 甜高粱莖稈糖分含量的變化分析[J]. 華北農學報，2009，24（增刊2）：69-71.王曉靜，李成奇，張金寶，等. 黃萎病菌脅迫下棉花根系茉莉酸、水楊酸含量的動態變化[J]. 江蘇農業科學，2016，44（2）：141-143.