人參銹腐病及疫病生防放線菌篩選

張鴻雁++劉勇++任勇洋

摘要：為獲得對人參銹腐病、疫病具有拮抗活性的土壤放線菌，利用平板稀釋培養法從黑龍江省人參基地和西北地區分離獲得578株放線菌，用瓊脂塊法初篩，用生長速率法、懸滴法對抑菌效果較好的菌株進行抑菌活性復篩。結果獲得5株對病原菌具有顯著拮抗性的生防放線菌，其中Act11、Act12菌株的拮抗效果尤為顯著，Act12最大抑菌圈直徑達20.15 mm，其發酵液對病原菌菌絲的抑制率最大為83.4%，對人參銹腐病孢子萌發抑制率最高為 99.8%。

關鍵詞：人參；生防放線菌；篩選；誘腐病；疫病

中圖分類號： S435.675文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0173-04

收稿日期：2015-03-20

基金項目：黑龍江八一農墾大學博士啟動基金（編號：XDB2015-17）。

作者簡介：張鴻雁（1970—），女，黑龍江寶清人，博士，教授，研究方向為微生物資源與利用。E-mail：zhy2219@163.com。人參根系病害包括根腐病、銹腐病、立枯病、疫病、菌核病等，其中銹腐病、疫病危害嚴重。人參根系病害雖可以采用農藝措施預防[1-2]，但目前主要通過化學農藥防治[3]，該方法會造成人參藥用部分農藥大量殘留，嚴重影響人體健康及療效。因此，利用生物技術防治人參根系病害較之于其他作物更為重要，是保證人參藥材安全性的必要措施。生物制劑具有施用安全、不污染環境、不產生抗性等優點，具有良好的應用前景。目前國內外關于人參根系病害的生物防治研究主要集中在生防細菌[4]、生防真菌方面[5]，對生防放線菌研究的報道較少。放線菌作為抗生素的主要產生菌，在自然界中分布廣泛，產生活性物質的能力強，活性物質種類多，是值得關注的生防菌資源。本研究篩選對人參銹腐病、疫病病原菌有拮抗作用的生防放線菌，旨在為人參根系病害生物防治提供有較強拮抗作用的放線菌菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株供試病原菌共 5 株，分別為人參銹腐病菌3.3591（Cylindrocarpon destructans 3.359 1，以下簡稱3.3591），人參銹腐病菌R2（以下簡稱R2），西洋參銹腐病菌81782（C. destructans 81782，以下簡稱81782），西洋參銹腐病菌81783（C. destructans 81783，以下簡稱81783），西洋參惡疫霉81805（Phytophthora cactorum 81805，以下簡稱81805）。其中81782、81783 為相同病原菌的不同菌株，選用不同菌株的目的是研究不同生防放線菌對同一菌種不同菌株抑制作用的差別。供試放線菌共578株，其中408株分離自黑龍江省鐵力市桃山鎮人參土壤，170株篩選自青海、西藏、新疆等地區土壤的拮抗放線菌，由西北農林科技大學微生物資源研究室提供。

1.1.2培養基用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PDA）分離、純化、活化、保存病原菌。用高氏1號瓊脂培養基（GA）活化、拮抗性瓊脂塊制備培養放線菌。用GA液體培養基制備放線菌發酵液。

1.2方法

1.2.1皿內拮抗性篩選平皿初篩采用瓊脂塊法[6]。將制備好的病原菌菌懸液均勻涂布于PDA平板上，用打孔器從培養7 d的待篩放線菌平皿中打取直徑5 mm的放線菌瓊脂塊，正置于PDA平板上，28℃培養5～7 d，測定抑菌圈直徑及抑菌圈透明度。皿內復篩：將初篩得到的具有良好拮抗效果的放線菌菌株進行2次皿內拮抗復篩，方法同皿內初篩。計算不同抑菌程度的拮抗菌占供試放線菌的比例（S）和占拮抗放線菌的比例（A）。根據拮抗環寬度、透明度、放線菌產孢量，挑選出有應用價值的拮抗菌。

S=不同抑菌程度拮抗菌株數供試放線菌株數×100%；

A=不同抑菌程度拮抗菌株數供試拮抗放線菌株數×100%。

1.2.2無菌發酵濾液抑菌率測定無菌發酵濾液制備：將供試放線菌以一定比例接種到液體培養基中，28℃、150 r/min搖床振蕩培養9 d。將發酵液4 000 r/min離心5 min后，用0.45 μm滅菌微孔濾膜過濾除菌，得無菌濾液。

采用生長速率法[7]測定相對抑菌率。將濾液與冷卻至40℃左右的PDA培養基按體積比1 ∶4混勻倒平板，以同比例加入無菌水的PDA培養基為對照。用5 mm打孔器分別打取5株病原菌菌餅，置于PDA平板中央，每個處理3次重復，25℃培養7 d，定時測量菌落直徑，計算相對抑菌率（X）。

抑菌率（X）=（對照菌落直徑-5）-（處理菌落直徑-5）對照菌落直徑-5。

1.2.3無菌發酵濾液對病原菌孢子萌發的影響病原菌孢子懸液制備：將活化好的病原菌接種到PDA培養基上，28℃培養6～9 d，加入無菌水沖洗孢子至50 mL三角瓶中，用血球計數板測數，制得濃孢子懸液。按發酵液、無菌水體積比分別為1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5配制不同濃度的發酵濾液；加入病原菌孢子，使孢子濃度約為10億個/mL，每個處理3 次重復。25℃培養，用懸滴法[8]測定孢子萌發率。計算孢子萌發率（R）、抑制率（I）。

萌發率（R）=萌發孢子數總孢子數×100%；

抑制率（I）=（對照萌發率-處理萌發率）對照萌發率×100%。

1.2.4生防放線菌對病原菌菌絲的作用采用對峙培養法[9]測定菌絲相互作用。用特制金屬“U”形鏟在PDA平板兩側挖約0.5 cm寬的小槽，在小槽一側先接種放線菌，28℃培養4 d后在小槽另一側接種病原菌，然后在小槽上放置無菌蓋玻片，28℃繼續培養4 d，取出蓋玻片，于40倍顯微鏡下觀察菌絲間的相互作用。

2結果與分析

2.1放線菌對病原菌的皿內拮抗作用

從578 株生防放線菌中篩選到134株具有廣譜拮抗性的放線菌，其中來自西北地區土壤的菌株58株，占供試放線菌的10.0%，占廣譜拮抗菌的43.3%；來自人參基地的菌株76株，占供試放線菌的13.1%，占全部拮抗菌的56.7%。

試驗表明，在134株拮抗菌中，對5株病原菌81782、81783、3.3591、R2、81805的皿內抑菌圈≥20 mm，且抑制圈透明的放線菌分別有11、14、6、9、21株，分別占全部拮抗菌總數的8.2%、10.4%、4.5%、6.7%、15.7%。由表1可見，對5株病原菌拮抗性強的菌株（抑菌圈≥15 mm）分別為38、40、40、33、67株，占全部廣譜拮抗菌的28.4%、29.9%、29.9%、24.6%、50.0%。從表1還可見，篩選出的拮抗菌對81805的拮抗性最強，對R2的拮抗作用最弱。

從表1可見，在篩選到的 134 株具有廣譜拮抗性的放線菌中，對西洋參銹腐病菌同一菌種不同菌株81782、81783而言，拮抗性強和無抗性放線菌在拮抗放線菌總數中所占比例相當，分別為28.4%、29.9%和3.0%、5.2%。說明同一拮抗菌對同一病原菌的不同菌株拮抗性略有差異。

表1中，從來源于黑龍江省人參產區的76株廣譜拮抗菌對5株病原菌的拮抗性看，對81805拮抗性強的菌株最多（26.1%），其次是81782（20.1%）、81783（19.4%），對分離自黑龍江省人參產區的毀滅柱孢菌R2 抗性強的拮抗菌最少（14.2%），但對該菌具有中等拮抗性的放線菌最多（25.4%）。

經初篩，有9株拮抗菌拮抗作用較強，分別為來源于黑龍江省人參產區土壤的6株拮抗菌114、184-3、224、15-2、23-2、110-2和來源于西北地區土壤的3株拮抗菌Act11、Act12、Act1。9株拮抗菌對5株病原菌的抑制作用均很強，且拮抗環完全透明、產孢量較高。

2.29株放線菌無菌發酵濾液對供試病原菌的抑制作用

從表2可見，9株生防菌無菌發酵濾液對5株病原菌均有抑制作用，即均能產生抗菌物質，抑制病原菌生長，其中來源于黑龍江省人參產區土壤的114、184-3、224和來源于西北地區土壤的Act11、Act12抑菌效果表現突出。

從表2可見，7 d時9株拮抗放線菌對81782、81783的抑制效果相當，抑菌率分別為14.9%～57.0%和16.6%～54.2%，其中114、184-3、224、Act11、Act12菌的抑菌效果較好。7 d 時9株拮抗放線菌對人參銹腐病菌3.3591的抑制率為16.6%～64.2%，其中Act11、114、Act12菌的抑菌效果較好，Act12放線菌在6 d時的抑菌率達69.4%。7 d 時9株拮抗放線菌對毀滅柱孢菌R2的抑制率為7.8%～66.9%，Act12、Act11、114、184-3、224菌的抑制效果較好；在5 d時，184-3菌的抑菌率為80.9%。7 d 時9株拮抗菌對81805的抑制效果優于其他4株病原菌，抑菌率為31.4%～73.4%，Act12菌在6 d時的抑菌率為83.4%。

2.3無菌發酵濾液對病原菌孢子萌發率的影響

率達到65%以上，其中Act11、Act12菌對81782孢子和224、Act11菌對81783孢子萌發的抑制作用較強。在發酵液、無菌水體積比為1 ∶2時，Act11、Act12菌對81782孢子萌發的抑制率分別為80.9%、89.3%，224、Act11菌對81783孢子萌發的抑制率分別為90.9%、90.7%。110-2、15-2菌的抑制能力最差，在發酵液、無菌水體積比為1 ∶5時，這2株菌還有促進81782孢子萌發的作用。

從表3可見，114、184-3、224、Act11、Act12菌對人參銹腐病菌3.3591、毀滅柱孢菌R2孢子萌發的抑制率達到65%以上。這5株拮抗菌發酵液對3.3591、R2的拮抗能力超過81782、81783。其中Act11、Act12菌的抑制作用最強，在發酵液、無菌水體積比為1 ∶2時，Act12放線菌對3.3591、R2孢子萌發的抑制率分別達98.0%、99.8%。對于病原菌81805，孢子萌發的抑制率強的菌株同其他4株病原菌，在發酵液、無菌水體積比為1 ∶2時，Act11菌的抑制率為97.1%，Act12、184-3、114抑制率分別為87.7%、87.4%、87.4%。

3結論與討論

針對人參根部病害的生物防治研究集中于細菌、真菌，有關放線菌的研究較少，且現有放線菌研究主要在韓國及吉林省人參產區進行，尚未見黑龍江省人參產區銹腐病及疫病生防放線菌的研究。Shim 等從韓國人參土壤中分離出3株鏈霉菌（S. variabilis、S. virgincae、S.grisedus），發現其對人參銹腐病菌有拮抗作用[10]。周淑香等從吉林省人參根際土壤中篩選到2 株對人參銹腐菌均有較強抑制作用的放線菌，施用該放線菌后人參銹腐病病情指數顯著降低，防治效果達40%以上，人參產量比對照有所增加，對參根成活率、株高和莖粗影響不顯著[11]。馬廷會從吉林省人參地篩選到對銹腐病有拮抗性的放線菌菌株MS32，抑菌率為76.45%，并對其進行了發酵條件研究和菌株鑒定，認為其可能是S. naraensi[12]。

本研究篩選出5株生防放線菌，對人參根系病害病原菌表現出良好的拮抗性，其中Act12、Act12放線菌的拮抗效果尤為明顯，其他3株生防放線菌對病原菌也表現出一定拮抗性。

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