櫻桃谷肉鴨大腸桿菌病PCR鑒定及治療藥物篩選與應用

黃銀云++胡新崗++郭廣富++徐婷婷

摘要：為給如皋地區養鴨合作社肉鴨養殖診治大腸桿菌病提供依據，采用PCR技術鑒定長期困擾養鴨業疑似大腸桿菌病的病原，通過27種藥敏制片試驗篩選出適合當地的先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋辛、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B等6種高敏藥物及頭孢哌酮、頭孢曲松、羧芐西林、氨芐西林等4種中敏藥物，確定鏈霉素、卡那霉素、新霉素、強力霉素、氧氟沙星等17種抗菌藥物不適于在該地區應用。并采用6種高敏藥物分組，治療病鴨均取得了良好的臨床療效。

關鍵詞：櫻桃谷鴨；大腸桿菌病；PCR；藥敏試驗；療效

中圖分類號： S858.32文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0241-03

收稿日期：2015-03-22

基金項目：江蘇省高校“青藍工程”資助。

作者簡介：黃銀云（1977—），女，江蘇泰州人，碩士，副教授，主要從事動物疫病防控研究及動物醫學專業教學工作。E-mail：gxh008@qq.com。隨著集約化養鴨業的發展，大腸桿菌病已嚴重威脅到養鴨業的健康發展。大腸桿菌屬于條件性致病菌，當由于各種應激刺激造成鴨體的免疫功能降低時，鴨群就會發生感染[1]。該病既可通過消化道感染，也可通過呼吸道感染，甚至可以通過種蛋垂直傳播。肉鴨發病多見于10～30日齡，發病率和死亡率較高，臨床常見肝周炎、氣囊炎、心包炎和腦炎病變[1-2]。常見的發病原因包括鴨舍環境衛生差、空氣污濁灰塵多、不重視消毒預防、引進帶有大腸桿菌的鴨苗等。此外，由于養殖戶缺乏科學給藥知識，臨床上頻繁使用某些抗菌藥物，導致地方性大腸桿菌耐藥嚴重，治療效果不佳，而抗菌藥物雖然可以暫時控制疫情發展，但停藥后常會復發，給鴨場造成了極大的損失[3]。江蘇省如皋市某櫻桃谷肉鴨養殖合作社長期受疑似大腸桿菌病困擾，筆者應用PCR技術鑒定該病病原，并通過藥敏試驗篩選了該合作社可用的敏感藥物，并取得了很好的臨床效果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器設備Mikro200R冷凍高速離心機、JS-380A自動凝膠圖像分析儀、PCR儀（PTC-200rev）、DYY-7C型電泳儀、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳槽、恒溫箱、微量移液器等。

1.1.2試劑麥康凱平板、伊紅美蘭平板、鮮血平板培養基，由江蘇省動物流行病學研究中心制備提供；TSB培養基、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2、10×PCR buffer、100 bp DNALadder和6× DNA 凝膠載入染料（LoadingDye），均為上海生工生物工程有限公司產品，其他試劑均為國產分析純。

1.1.1病料選取如皋市某櫻桃谷肉鴨養殖合作社疑似感染大腸桿菌新鮮病死鴨10羽，無菌采集肝臟、脾臟、心臟和大腦，-20 ℃保存備用。

1.1.2藥敏試紙先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢氨芐、頭孢他啶、紅霉素、麥迪霉素、美滿霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、萬古霉素、多黏菌素B、氧氟沙星、羧芐西林、哌拉西林、氨芐西林、鏈霉素、卡那霉素、強力霉素、諾氟沙星、鹽酸環丙沙星、慶大霉素、克林霉素、四環素、桿菌肽共計27種藥敏紙片，購于杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3試驗動物試驗鴨為如皋市某養鴨合作社發生大腸桿菌病的600羽20日齡櫻桃谷鴨。試驗于2014年5月4日至6月9日進行，試驗期間均按照該養鴨合作社的常規飼養管理辦法進行日常飼養與管理，重視帶鴨消毒。

1.2方法

1.2.1細菌分離及TSB培養基增菌無菌劃線分離，將病料接種于鮮血平板培養基，置于37 ℃燭缸中培養24 h，觀察菌落形態和溶血情況。經革蘭氏染色鏡檢后，挑取目的菌落，利用TSB培養基增菌。同時接種于麥康凱、伊紅美藍培養基，37 ℃培養24 h，觀察其生長特性。

1.2.2細菌DNA的提取細菌DNA提取采用熱裂解法[4]。

1.2.3PCR檢測細菌引物設計參照文獻[5]。以提取的細菌DNA為模板進行PCR擴增，PCR采用50 μL反應體系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、上下游引物各1 μL、3 μL cDNA、Taq DNA聚合酶 1 μL，用滅菌超純水補足50 μL。反應條件為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結果。

1.2.4藥敏試驗將經過分離純培養的菌株按KB紙片法進行藥敏試驗[6]，37 ℃溫箱培養24 h，分別測量藥敏紙片的抑菌圈直徑的大小，結果按美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）的標準判斷（表1）。

1.2.5治療設計將600羽病鴨隨機分成6組，每組100羽。根據藥敏試驗結果，選擇藥物敏感性較好的6種藥物進行治療，對應的組別分別是先鋒霉素Ⅴ組、先鋒霉素Ⅵ組、頭孢呋辛組、丁胺卡那霉素組、紅霉素組、多黏菌素B組。治愈判定標準：臨床癥狀基本消失，精神、飲食、糞便正常。觀察療效，統計治愈率，用統計學方法分析各組間療效差異顯著性。

2結果

2.1分離菌株的培養特性

目的菌為革蘭氏染色陰性短小桿菌。鮮血平板培養的菌落灰白色，呈凸起圓形，光滑而濕潤，無溶血；在麥康凱培養基上呈粉紅色菌落；伊紅美藍平板上形成的菌落呈黑色且有金屬光澤。

2.2PCR擴增結果

對病料進行PCR檢測，得到大腸桿菌OmpA目的基因片段，片段大小為408 bp（圖1），與預期的結果相符。確診該養殖合作社肉鴨感染大腸桿菌病。

2.3藥敏試驗結果

試驗結果見表1。在本試驗病料采集地，鴨源大腸桿菌對先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋辛、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B等6種試驗藥物高敏，對頭孢哌酮、頭孢曲松、羧芐西林、氨芐西林等4種試驗藥物中敏，而對其他試驗藥物耐藥。根據試驗結果，高敏藥物和中敏藥物均可用于該群病鴨的治療，以高敏藥物為佳。

2.4治療效果

由藥物治療試驗結果（表2），采用經藥敏試驗選取的治療藥物，臨床均能及時控制疫情并取得了較理想的治療效果。先鋒霉素類的先鋒霉素Ⅴ組、先鋒霉素Ⅵ組、頭孢呋辛組之間治療效果差異不顯著（P>0.05）；丁胺卡那霉素組與先鋒霉素類組比較差異不顯著（P>0.05）；紅霉素組與多黏菌素B組比較，差異顯著（P<0.05），這2組與先鋒霉素類組間比較差異亦顯著（P<0.05）。

3分析與討論

研究表明，鴨病原性大腸桿菌血清型復雜，不同地區的血清型存在差異[7]。此外，鴨大腸桿菌病與鴨疫里默氏桿菌病都是危害肉鴨養鴨業最重要的傳染病，2種病的臨床表現極為相似，診斷時容易混淆。這些都導致大腸桿菌病采用病原學診斷具有一定的困難。而PCR診斷具有方便、快捷、特異性強、診斷結果準的特點，為鴨大腸桿菌病的快速診斷、及時處理提供了準確可靠的依據[5]。

在如皋地區，肉鴨源大腸桿菌對先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋辛、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B最為敏感，可能與這些藥物在該地區臨床應用頻度小有關。頭孢氨芐、頭孢他啶 、鏈霉素、慶大霉素、強力霉素等藥物可能由于廣泛而長期應用，導致其耐藥性也較為嚴重。本次藥敏試驗也表明，鴨源大腸桿菌的多重耐藥性還是比較嚴重的，應給予足夠重視。這也提醒養殖戶一旦發現疫情，應立即向畜牧獸醫部門求助，及時通過藥敏試驗選取有效治療藥物，以免錯誤用藥貽誤最佳治療時機。在用藥時要注意輪換、聯合、交叉用藥，盡量不給細菌產生耐藥性的機會。

大腸桿菌作為條件性致病菌，對污染的環境適應性強，不重視鴨舍環境衛生，不進行鴨舍場地消毒，是該養鴨合作社肉鴨養殖中連續多批次發病的主要誘因。因此，實行引進鴨苗檢疫、執行全進全出制度、嚴格遵守獸醫衛生防疫制度、加強飼養管理、減少應激因素是養鴨業預防鴨大腸桿菌病的有效措施。

參考文獻：

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