無血清微載體培養Vero細胞增殖傳染性法氏囊病毒

吳培培++馮磊++唐應華++褚軒+王偉峰+侯繼波

摘要：為了獲得用生物反應器無血清培養基微載體懸浮培養Vero細胞增殖傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）的工藝參數，通過馴化Vero細胞適應無血清微載體懸浮培養后，再優化傳染性法氏囊病毒在此細胞上的增殖工藝參數，包括初始細胞密度、微載體濃度、IBDV的感染復數（MOI）、接種時間和病毒收獲時間。結果表明：獲得適應無血清培養的細胞株——V0株，建立細胞庫。獲得3 L反應器中培養V0細胞增殖IBDV工藝參數，其初始接種密度為3×105 cell/mL、微載體濃度為3 g/L、細胞培養1 d后按MOI為0.2接種IBDV，接毒后120 h收獲病毒，可達最高病毒效價109.307 TCID50/mL。本研究獲得的Vero細胞、IBDV以及各項工藝參數為后續大規模懸浮培養制備法氏囊疫苗提供了生物材料和技術支持。

關鍵詞：無血清培養；Vero細胞；傳染性法氏囊病毒（IBDV）；微載體；生物反應器；增殖工藝

中圖分類號： S858.31文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0244-03

收稿日期：2015-02-03

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（15）5045]。

作者簡介：吳培培（1982—），女，江蘇南通人，碩士，助理研究員，從事獸用生物制品工程技術研究。 Tel：（025）84392018；E-mail：wupeipei2015@163.com。

通信作者：侯繼波，男，山東德州人，博士，研究員，從事獸用生物制品工程技術研究。E-mail：houjibo@jaas.ac.cn。雞傳染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD），是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起的雞的一種高度接觸性傳染病[1]。1980年以后該病傳入我國并大面積暴發和持續流行，嚴重影響了我國養雞業的發展，當前對于該病采用接種疫苗進行預防[2]。目前，國內生產IBDV疫苗大部分采用雞胚成纖維細胞增殖病毒，在培養過程中需添加一定量胎牛血清或小牛血清，以提供細胞生長增殖所必需的各種生長因子。隨著動物細胞無血清培養技術的不斷進步，無血清培養已成為包括疫苗在內的生物技術藥物生產的總趨勢[3-4]。當前國內疫苗生產方式延用了傳統的實驗室滾瓶培養方式，由于每個轉瓶的細胞質量、病毒產量和滴度都不同，導致疫苗的批間差很大。隨著生物反應器的發展，大規模轉瓶培養動物細胞疫苗工藝技術向生物反應器培養動物細胞疫苗工藝技術的轉變成為必然[5-6]。本研究對從美國組織細胞標準菌種保藏中心（ATCC）引進的10%小牛血清培養的Vero細胞進行無血清馴化，最終獲得無血清培養Vero細胞株；在實驗室小規模微載體懸浮培養無血清Vero細胞，并優化IBDV的增殖條件，病毒能夠高效增殖且免疫原性好，為后期大規模微載體懸浮培養無血清Vero細胞增殖IBDV提供研究基礎。

1材料與方法

1.1細胞和病毒

Vero細胞由國家獸用生物制品工程技術研究中心（簡稱“中心”）購自ATCC，以10% FCS DMEM傳代培養，并建立Vero細胞原始庫；IBDV為中心保藏毒種。

1.2試劑與儀器

無血清培養基：不含血清，也不含任何動物來源成分的無血清培養基，購于GIBCO公司，設計用于數種腎臟來源細胞系的生長。筆者所在實驗室通過培養基成分優化，添加適量的生長因子使該培養基更加適合細胞生長[7]。

微載體購自GE公司。用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液清洗并浸泡3 h后，經121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，冷卻后儲于4 ℃密封待用。使用前用37 ℃的細胞培養液清洗2遍。

3 L動物細胞反應器購于荷蘭Applikon Biotechnology公司，反應器培養工作體積0.5～2.7 L，具有溶氧（DO）、pH值、溫度、轉速及四氣（N2、O2、CO2及空氣） 控制系統。

1.3Vero細胞無血清適應培養[8]

將ATCC引進Vero細胞，采用無血清直接適應法培養。簡述如下：Vero細胞在含10% 胎牛血清（FCS）的DMEM中培養至對數生長期，用胰酶消化后，離心，用無血清培養基重懸后計數，按照1×105 cell/mL細胞量，以無血清培養基培養，每天觀察細胞形態和細胞活性，及時換液，去除死亡細胞，最終獲得無血清培養Vero細胞株V0，并凍存。

1.4細胞接種量和微載體濃度的優化

將馴化后的V0細胞消化后以1×105、3×105、5×105 cell/mL的初始接種密度分別接種到含有1、3、5 g/L微載體中。細胞在3 L反應器中培養，pH值7.0～7.2、DO飽和度50%、攪拌轉速60～80 r/min、溫度37 ℃。每天取樣觀察細胞生長狀態并計數。采用Nova 400全自動生化分析儀檢測細胞培養基中的葡萄糖（Gluc）、谷氨酰胺（Gln）、乳酸（Lac）和銨離子（NH4+）等營養成分及代謝產物的含量，試驗結果用OriginPro 8.0軟件進行數據分析。

1.5病毒接種量和收獲時間的優化

在3 L反應器中，V0細胞接種量為3×105 cell/mL、微載體濃度為3 g/L，pH值7.0～7.2、DO飽和度50%、攪拌轉速60～80 r/min、溫度37 ℃。培養1 d后，將IBDV病毒分別以不同的病毒感染復數（MOI）0.2、0.5、1感染V0細胞，37 ℃培養，分別于感染后的24、48、72、96、120、144 h取樣收獲病毒，反復凍融3次后，取上清在CEF細胞上檢測病毒的50%組織細胞感染量（TCID50），篩選出合適的病毒接種量和收獲時間。

2結果與分析

2.1獲得適應無血清培養的Vero細胞

經直接無血清適應，篩選獲得能在無血清培養基中生長的Vero細胞。在適應過程中，細胞外觀表現為逐漸拉長，但仍為上皮樣細胞樣特性（圖1-A）。細胞生長速度較有血清條件下緩慢，一般需2 d才能達到對數生長期。經逐步傳代適應后，無血清培養細胞對數生長期提前至1 d，與正常有血清培養的Vero細胞生長接近。

2.2最佳初始接種密度為3×105 cell/mL

采用3 g/L的微載體，V0細胞的初始接種量分別為1×105、3×105、5×105 cell/mL，每天取樣觀察細胞狀態、計數及培養基營養成分分析。細胞初始接種密度過低（1×105 cell/mL）時，細胞生長缺乏初始密度效應而造成生長相對緩慢，細胞終密度也相對較低。細胞初始接種密度為3×105 cell/mL時，接種后6 h細胞貼附到微載體上，細胞黏球率（每個微載體上黏附的細胞表面積占微載體總面積比例）為25%，培養2 d后細胞開始進入對數生長期，細胞黏球率為50%，培養至4 d，細胞達到最大密度1.18×106 cell/mL，黏球率95%以上（圖1-B）。細胞密度過高（5×105 cell/mL），初始占球率就比較高，約50%左右，細胞生長空間有限。

對不同初始密度接種的細胞培養條件進行取樣檢測，主要檢測細胞培養基中的Gluc、Glu、Lac和NH4+營養成分及代謝產物的含量。檢測結果（圖2）表明，較高的初始接種密度（5×105 cell/mL）會導致細胞生長液中的Gluc、Glu消耗過快，在生長過程中累積較多的Lac和NH+4。細胞初始密度為3×105 cell/mL時，細胞均勻分布于每個微載體表面，同時也為后續預留了充裕的生長空間，細胞生長良好，最終獲得較高細胞終密度。

2.3最佳微載體濃度為3 g/L

采用細胞的初始接種量3×105 cell/mL，微載體濃度分別為1、3、5 g/L，取樣觀察細胞狀態、計算細胞數量，繪制細胞生長曲線，結果（圖3）表明，微載體濃度偏低（1 g/L）時，細胞相對微載體偏多，導致初始黏球率高，在50%以上，細胞后期缺乏生長空間。微載體濃度為3 g/L時，接種后6 h細胞貼附到微載體上，黏球率約為25%；培養2 d后細胞生長進入對數生長期，黏球率約為50%，培養至4 d，細胞達到最大密度1.18×106 cell/mL，黏球率95%以上（圖4）。微載體濃度偏高（5 g/L）時，會導致初始黏球率偏低，約10%以下，與微載體數量相比，細胞數量相對較低，細胞生長因缺乏初始密度效應而造成生長相對緩慢。

2.4最佳病毒接種量為0.2 MOI和收獲時間為120 h

V0細胞微載體懸浮培養，初始接種密度3×105 cell/mL、微載體濃度3 g/L，培養24 h后，細胞100%貼附微載體，分別

按照0.2、0.5和1的MOI感染Vero細胞，37 ℃培養5 d后收獲病毒液，反復凍融3次后，取上清在CEF細胞上檢測病毒的TCID50。檢測結果表明，接種0.2 MOI的IBDV，感染V0細胞120 h后，收獲病毒，病毒效價可達109.368 TCID50/mL（表1）。IBDV病毒感染24 h后，取樣觀察細胞，細胞數量增多，無脫落現象，病毒效價沒有增長；感染72 h后，細胞開始出現部分脫落現象，病毒效價開始增長；感染96～120 h，病毒效價明顯增長，大部分細胞從微載體上脫落；感染144 h后，病毒效價開始降低（表1）。

3討論與結論

在生物反應器中以持續攪拌的方式用微載體懸浮培養動物細胞，與滾瓶培養細胞方式相比，前者營養物質、氣體及熱量的傳遞更加充分均勻，為細胞生長及病毒增殖提供相對優質、恒定的培養環境，整個生物過程控制精確，易于重復。所以采用生物反應器微載體懸浮培養細胞，制備抗原，更有利于保證疫苗產品質量穩定，并有利于規模化放大[9]。以生物反應器微載體懸浮培養Vero細胞增殖IBDV技術將成為我國獸用疫苗生產的趨勢。

本研究馴化獲得無血清培養的Vero細胞株，并對其在實驗室小規模培養條件下增殖IBDV的條件進行優化。采用3種不同細胞接種量分別接種3種不同濃度的微載體，結果表明，細胞接種量在3×105 cells/mL、微載體濃度在3 g/L時，細胞增殖狀態良好，細胞最終密度達到1.18×106 cell/mL。本次結果與賈涵婧等的結果[10]一致，即當1個微載體周圍的細胞數控制在一定范圍之內，能夠使細胞生長獲得一個較為穩定的平臺期。葡萄糖、谷氨酰胺等營養物不會消耗過多以致耗竭，而乳酸、銨等代謝副產物的累積對培養環境造成的壓力較小，有利于細胞生長，最終獲得一個比較高的細胞密度。

病毒接種量過高，會產生大量的不完全病毒；病毒接種量過低，又會影響病毒的產量[8]。本研究結果亦提示，MOI為0.2時，接毒后96～120 h IBDV的TCID50最高。IBD病毒感染Vero細胞后72～96 h，病毒效價開始上升，120 h后病毒效價達到峰值，144 h后病毒效價有所下降，故確定IBD病毒適宜的收獲時間為120 h。

綜上所述，本試驗優化了無血清微載體培養Vero細胞和增殖IBD病毒的實驗室小規模培養的適宜條件，采用Applikon的3 L生物反應器對無血清Vero細胞進行培養，控制細胞培養的溫度、溶氧、pH值，進行不同細胞量、微載體濃度、病毒接種量和收毒時間的優化，為應用大型生物反應器大規模制備IBDV疫苗奠定了基礎。

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