生物反應器中PRRSV工業規模增殖工藝的建立

馮磊++王偉峰++吳培培++褚軒++陳麗++侯繼波

摘要：分析比較了3種不同微載體懸浮培養工藝——分批換液式、消化傳代放大式、循環灌注培養式對Marc-145細胞微載體培養效能及生理代謝的特點及差異，并實現了從5 L至60 L反應器放大過程的PRRSV實際增殖應用。結果表明，在5 L動物細胞反應器中使用相同的微載體用量6 g/L，分批換液式培養和消化傳代放大式培養僅獲得27×105～28×105 cells/mL的細胞密度，低于循環灌注培養式的培養能力（59.4×105 cells/mL）。根據這3種不同培養工藝的特點，設計并實施了可應用于實際生產的工藝流程，即Marc-145種子細胞以循環灌注培養方式在5 L反應器中完成初級培養，經消化傳代工藝，將種子細胞放大接種于60 L反應器中進行分批換液式的二級培養，用于PRRSV的大規模增殖，結果顯示PRRSV增殖滴度可達到108.3TCID50/mL。該過程成功地模擬了Marc-145細胞在工業級水平上的放大培養操作工藝，其放大倍數達到1 ∶3的傳代系數，具備實際應用價值。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；微載體培養；Marc-145細胞；循環灌注培養；分批換液式培養；消化傳代式培養

中圖分類號： Q943.1；S858.285.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0247-05

收稿日期：2014-12-26

基金項目：公益性行業（農業）科研專項（編號：201303046）。

作者簡介：馮磊（1979—），男，江蘇南通人，博士，副研究員，主要從事獸用生物制品工程技術研究。E-mail：fenglnt@hotmail.com。

通信作者：侯繼波，研究員。E-mail：houjibo@jaas.ac.cn。豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種嚴重危害養豬業的傳染病（豬藍耳病）[1]。控制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的主要辦法是使用疫苗進行免疫防控，而提高病毒增殖規模及滴度是疫苗生產的一個重要目標。目前該疫苗的生產用細胞株為Marc-145細胞[2]，具體的生產工藝依然是實驗室滾瓶培養工藝的簡單數量放大，其生產規模、產品質量都有待于進一步提高。在生物反應器中完成細胞株的懸浮培養及病毒增殖，并按照工業規模要求完成規模放大是亟待解決的難題。

自從1976年van Wezel開發出動物細胞微載體培養技術[3]，生物制藥領域進入了利用體外動物細胞培養工藝大規模生產重組蛋白、抗體、細胞因子、疫苗等生物技術藥物的高速發展時期[4-5]。到目前為止，微載體懸浮培養技術已在多種疫苗，如狂犬病疫苗[6]、人流感疫苗[7]、黃熱病毒疫苗[8]等大規模制備中起到關鍵性的作用。同時動物細胞的微載體懸浮培養也逐步形成了一些獨特的培養條件、放大工藝及病毒增殖策略，以適用于不同的疫苗制備工藝需求。

本研究以Marc-145細胞為研究對象，在實驗室5 L動物細胞反應器中考察了分批換液式、消化傳代放大式、循環灌注式3種不同培養工藝對該細胞在微載體（cytodex 1）上生長及代謝的影響，按照該疫苗工業生產要求，評價并設計出不同培養工藝在細胞培養、病毒增殖過程中的具體應用模式，最終在60 L培養體積中實現整個病毒增殖過程，為我國PRRS疫苗的規模化生產提供應用基礎。

1材料與方法

1.1細胞及種毒

Marc-145細胞為國家獸用生物制品工程技術研究中心保藏細胞株。PRRSV為國家獸用生物制品工程技術研究中心保藏毒種。

1.2材料及設備

1.2.1微載體cytodex 1購自GE公司。用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液清洗并浸泡至少3 h后，經121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min冷卻后儲于4 ℃密封待用。使用前用37 ℃的細胞培養液清洗2遍。

1.2.2試劑細胞培養液DMEM購自默克密理博清大天一科技有限公司。新生牛血清購自Gibco公司。配制成含有5%新生牛血清的DMEM培養液，其中含有100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，經無菌0.22 μm膜過濾除菌，4 ℃冷藏備用。胰蛋白酶購自Invitrogen公司，用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液配制成0.25%濃度的胰蛋白酶溶液，調整pH值至7.5～8.0，經無菌0.22 μm膜過濾除菌，4 ℃冷藏備用。

1.2.3設備5 L動物細胞反應器由華東理工大學國家生化工程技術研究中心（上海）制造，反應器培養體積范圍1.2～4.0 L，具有溶解氧（DO）、pH值、溫度、轉速及四氣（N2、O2、CO2、空氣）控制系統。

60 L動物細胞反應器由默克密理博北京清大天一科技有限公司制造，反應器培養體積為48 L，具有DO、pH值、溫度、轉速及四氣（N2、O2、CO2、空氣）控制系統。

1.3試驗方法

1.3.15 L生物反應器中Marc-145細胞微載體懸浮培養分批換液式操作DO電極、pH電極標定及罐體安裝完畢，經121 ℃高壓滅菌45min及預培養1 d（無菌檢測）后，用于Marc-145細胞的微載體懸浮培養，微載體用量分別為3、6、9 g/L，初始細胞接種密度均為3×105 cells/mL，培養體積為4 L，利用分批換液式操作，即將培養液、細胞及微載體一次全部投入進行細胞培養，培養過程中根據實際情況進行換液操作。控制DO為50%飽和度，pH值為7.0～7.1，攪拌轉速為25～40 r/min，培養溫度為37 ℃。每天從反應器中吸取樣品，測定細胞密度和培養液中營養成分濃度、代謝副產物濃度等。

不同培養方式的反應器預備安裝、滅菌流程及過程參數的設定均同上所述，以下不再贅述。

1.3.25 L生物反應器中Marc-145細胞微載體懸浮培養消化傳代放大式操作初始培養時微載體用量分別2、3 g/L，初始細胞接種密度為3×105cells/mL，培養體積分別為4 L。經過初始培養后，對2、3 g/L的微載體培養物進行消化操作，使細胞從微載體上消化脫落，將消化后的細胞和舊微載體一并分別接種于16 g和12 g新微載體中，進行消化傳代后放大再培養，微載體的終濃度均為6 g/L，培養體積均為4 L。每天從反應器中吸取樣品，測定細胞密度和培養液中營養成分濃度、代謝副產物濃度等。

1.3.35 L生物反應器中Marc-145細胞微載體懸浮培養循環灌注式操作微載體用量為6 g/L，初始細胞接種密度為3.5×105 cells/mL，培養體積為4 L。培養24 h后，開始進行循環灌注操作，操作前期進行每天1/2個培養體積的循環灌注量，隨著培養時間的延長及細胞生長的加快，將循環灌注的速率逐步提高至每天1～3個培養體積的循環灌注量。循環灌注操作需要安置1個大體積的貯液罐（貯液量10～12 L），通過2個變速蠕動泵及硅膠管道將反應器和貯液罐閉環連接，形成培養液以一定流速從貯液罐中泵入反應器的同時，培養液以相同的流速從反應器中泵回貯液罐。每天分別從反應器和貯液罐中吸取樣品，測定細胞密度和培養液中營養成分濃度、代謝副產物濃度等。

通過上述3種操作方式，在5 L動物細胞反應器中最終實現的都是在6 g/L微載體用量下進行Marc-145細胞的微載體懸浮培養，比較不同操作方式的培養效能。

1.3.4消化后Marc-145細胞在60 L生物反應器中微載體懸浮培養操作及PRRSV接毒增殖操作經消化處理后的Marc-145細胞檢測細胞活率，按照初始細胞密度3.0×105 cells/mL 重新接種于新微載體中，微載體的使用濃度為 3 g/L，培養體積為48 L。設置細胞培養過程pH值、DO及溫度為自動控制。培養過程中每天檢測細胞密度、營養物濃度及代謝副產物的濃度。視培養的具體情況選擇換液或其他操作輔助細胞生長。

待細胞密度增長至2×106～3×106 cells/mL進行接毒操作，PRRS種毒以MOI=0.05接入微載體懸浮培養Marc-145細胞的60 L反應器中[9]，接毒后24、48、72 h取樣測定PRRSV的效價。

2結果與分析

2.1Marc-145細胞微載體懸浮培養的分批換液式操作

一次性將細胞和微載體投入反應器進行懸浮培養是一種常用的簡單培養方式，增加微載體的用量即可增加細胞生長表面，進而收獲更多的細胞，但試驗結果表明，采用相同的初始細胞密度3.0×105cells/mL進行Marc-145細胞接種培養，微載體的濃度直接影響最終的培養效果（圖1）。3 g/L的微載體用量可獲得較好的細胞生長效果，培養3 d通過換液操作使得Marc-145細胞在培養6 d獲得最大活細胞密度23.8×105 cells/mL。而9 g/L的微載體用量條件下細胞不能正常生長，雖然其提供了最大的細胞生長表面，但3.0×105 cells/mL 的初始接種密度過低，分配在每個微載體上的初始細胞個數太少，細胞生長的延遲期維持了3 d之久，雖然在培養3、6 d進行了2次換液操作，細胞仍然生長緩慢。此外 9 g/L 的微載體濃度使得細胞培養液的流動性變差，氣體及熱量的傳遞無法按照牛頓流體的線性控制完成，影響了最終的培養效果，同時也說明該生物反應器的最大混合能力不能支持動物細胞在9 g/L的微載體使用濃度上進行生長。通過2次換液操作，6 g/L微載體在3.0×105 cells/mL的初始接種密度下，可以達到27.2×105 cells/mL的最大活細胞密度；但通過顯微觀察，微載體表面依然有較多的空隙，并沒有達到細胞生長的最大效能，這可能就是分批換液式培養工藝的局限性。

2.2Marc-145細胞微載體懸浮培養的消化傳代放大式操作

Marc-145細胞分別在2 g/L和3 g/L的微載體濃度下

進行初始培養，分別在培養后3、4 d通過胰酶消化作用，使得細胞從微載體上脫落，形成細胞與微載體的混懸液。該混合物再重新接種于16 g和12 g新微載體中，培養體積均為4 L，進行消化傳代后放大再培養，結果如圖 2所示。該試驗的實際目的就是利用消化傳代的方式將Marc-145細胞最終接種在6 g/L的微載體用量上進行培養（便于在整個研究中作比較），放大比例分別為1 ∶3和1 ∶2。結果表明，Marc-145細胞在經過消化操作后，細胞活力有不同程度的損傷，活細胞密度降低，直接影響了細胞的重新爬球，使得細胞重新爬球后再生長的延遲期時間延長，最終最大活細胞密度在2個放大比例組別中沒有明顯差異，在28×105 cells/mL 左右。該試驗說明，利用胰酶消化可以進行微載體培養的傳代放大，但其消化工藝需要進行優化，盡量避免細胞經消化后的活力損傷，影響放大再爬球生長的效果。

2.3Marc-145細胞微載體懸浮培養的循環灌注式操作

利用循環灌注的培養方式進行Marc-145細胞微載體懸浮培養，結果如圖3所示。根據前面試驗的結果，適度提高初始接種細胞密度達到3.5×105 cells/mL，微載體用量為6 g/L（便于在整個研究中作比較），同時在培養1 d后開始進行連續循環灌注操作，灌注速率為0.5個培養體積/d，隨著培養時間的延長，灌注速率逐步在培養2～4 d提高到1.0～1.5個培養體積/d，在培養4～7 d提高到1.5～3.0個培養體積/d。通過這種方式，Marc-145細胞獲得比較好的培養效果，細胞進入快速生長的時間縮短，培養過程中沒有頻繁的罐上操作，利用變速蠕動泵將培養上清進行連續的密閉循環流動，為細胞提供相對較好的生長環境，培養6～7 d活細胞密度達到59.4×105 cells/mL，觀察微載體生長表面基本都被細胞所覆蓋，細胞層生長致密并維持較高的存活率。

2.43種培養方式條件下Marc-145細胞在微載體上生長、生理代謝的比較

3種培養方式對Marc-145細胞微載體懸浮培養的生

長、生理代謝產生不同結果（表1）。細胞在微載體上展開生長的延遲期長短與初始接種密度和微載體用量的比例有關，3.0×105 cells/mL的初始細胞密度對于3 g/L的微載體用量來說是比較適合的，表現為大致13 h的延遲期，提高微載體用量會造成延遲期的延長。如果適當提高初始細胞密度到3.5×105 cells/mL，在6 g/L微載體用量下也可獲得較快的初始生長。

循環灌注培養的Marc-145細胞平均倍增時間明顯小于其他2種培養方式，大致為13 h。同時培養周期也僅為最少的6～7 d，即可獲得最大的細胞密度59.4×105 cells/mL，平均比生長速率0.479 d-1，高于其他組別。

隨著培養時間的延長，考察培養液滲透壓的變化，結果表明，在經過較長時間的利用，雖然營養成分還沒有利用完，換液前或傳代前的培養液滲透壓已經達到或接近400 mOsm/kg，這樣的滲透壓對細胞生長極為有害，這可能是分批換液培養和消化傳代放大培養不能獲得高密度培養的原因之一。而直到循環灌注培養結束，培養液的滲透壓才達到391.5 mOsm/kg，因為利用循環灌注及時稀釋了細胞代謝出的副產物（乳酸和氨），同時也減少了培養過程中為了維持培養pH值而進行的補堿用量（NaHCO3），為細胞生長提供了相對較好的培養環境。

循環灌注培養為Marc-145細胞微載體懸浮生長提供了較好的培養環境，使得細胞生長代謝較為旺盛。測定各組別細胞的營養物和代謝副產物濃度，發現循環灌注培養的 Marc-145細胞對葡萄糖和谷氨酰胺的利用率高于其他組別，表現為葡萄糖比消化速率為2.065 mmol/（109 cells·d），谷氨酰胺比消耗速率為0.174 mmol/（109 cells·d），均高于其他組別，同時乳酸對葡萄糖的得率系數為1.228 mmol/mmol，低于其他組別，說明Marc-145細胞在循環灌注培養過程中能夠充分利用營養物，同時其代謝副產物乳酸的生成較少，葡萄糖代謝途徑部分減弱了乳酸生成的通量，而轉向用于生理代謝和細胞生物量的增加，進而表現為細胞對葡萄糖和谷氨酰胺的得率系數提高，分別達到0.081×109 cells/mmol和 0.958×109 cells/mmol，均高于其他組別。

2.5Marc-145細胞微載體一級、二級懸浮培養及PRRSV接毒增殖全過程

根據上述研究結果，設計出Marc-145細胞微載體懸浮培養、消化傳代放大、PRRSV接毒增殖的全過程：（1）Marc-145細胞凍存細胞復蘇之后，經2～3代的滾瓶擴增，接種至5 L動物細胞反應器，提高微載體的用量為6 g/L，采用循環灌注的培養方式進行一級培養，在短時間內獲得高密度的Marc-145細表13種培養方式條件下Marc-145細胞在微載體上生長、生理代謝的比較

項目Marc-145細胞不同培養模式分批換液培養消化傳代放大培養循環灌注培養3 g/L6 g/L2～6 g/L3～6 g/L6 g/L延遲期持續時間（h）131822（消化后）22（消化后）16平均倍增時間（h）1821212013接種細胞密度（×105 cells/mL）3.03.03.03.03.5最大細胞密度（×105 cells/mL）23.8±1.227.2±1.127.2±1.128.7±1.259.4±1.8細胞平均比生長速率（d-1）0.346±0.0140.312±0.0110.271±0.0120.284±0.0090.479±0.008培養周期（d）6～77～88～98～96～7培養液總量（L）812121216滲透壓（mOsm/kg）換液前或傳代前413.8387.3390.1395.4培養結束400.7409.4401.1405.8391.5葡萄糖比消耗速率[mmol/（109 cells·d）]1.791±0.0021.885±0.0061.872±0.0051.891±0.0072.065±0.005谷氨酰胺比消耗速率[mmol/（109 cells·d）]0.157±0.000 50.143±0.000 50.142±0.000 60.159±0.000 50.174±0.000 6乳酸比生成速率[mmol/（109 cells·d）]2.474±0.0042.628±0.0032.580±0.0052.619±0.0092.536±0.004氨比生成速率[mmol/（109 cells·d）]0.116±0.0020.115±0.0010.105±0.0010.118±0.0030.078±0.001乳酸對葡萄糖的得率系數（mmol/mmol）1.381±0.0021.394±0.0031.378±0.0021.385±0.0021.228±0.001細胞對葡萄糖的得率系數（×109 cells/mmol）0.079±0.0010.076±0.0020.067±0.0020.066±0.0040.081±0.003細胞對谷氨酰胺的得率系數（×109 cells/mmol）0.909±0.0010.874±0.0020.880±0.0020.789±0.0020.958±0.003

胞種子細胞，達到50×105 cells/mL，并保持較高的細胞存活率。（2）采用消化傳代操作工藝，使得種子細胞從舊微載體上脫落、分散，直接接入60 L動物細胞反應器中，與新微載體及新鮮培養液混合均勻，完成消化放大過程。整個消化及轉移放大過程在30 min內完成。（3）在60 L動物細胞反應器中，微載體用量為3 g/L，培養體積為45～50 L，采用分批式培養方式，根據細胞實際生長情況，適度更換培養液可完成Marc-145細胞的60 L反應器二級微載體懸浮培養過程，細胞密度達到25×105～30×105 cells/mL即可進行PRRSV接毒操作。以MOI=0.05進行PRRSV接毒，完成PRRSV的增殖過程，在接毒后2 d收毒，獲得最大增殖毒價為108.3 TCID50/mL（圖4）。整個5 L→60 L Marc-145細胞放大培養及PRRS病毒增殖過程控制在12 d左右，生產周期較短，操作簡單。接毒前和接毒后細胞在微載體上生長形態如圖5所示。

3討論

動物細胞進行微載體懸浮培養，其貼壁型生長特性沒有改變，所以在分批式培養中提高微載體的用量，供應更大的細胞生長表面，即可獲得更高的細胞密度。但對于類似Marc-145細胞這樣對初始細胞密度有一定依賴性的細胞，過度提高微載體用量會造成細胞無法正常啟動生長，使得細胞生長的延遲期大大延長，培養周期也隨之延長，在培養后期無法獲

得較好的培養效果。此外，每臺攪拌式生物反應器的混合供氧效能是基本一定的，即在細胞能夠忍受的最大攪拌和通氣條件下，其攪拌混合微載體培養物的能力是一定的，盲目提高微載體的用量會使得培養環境中攪拌混合的效果變差，直接導致傳氧、傳質的效果變差，細胞無法正常生長。所以選用適宜的微載體用量及與之相匹配的細胞初始接種密度，可以獲得較好的培養效果，同時也縮短培養周期。

消化傳代放大培養方式模擬了工業生產中細胞培養放大再培養的過程，如何讓細胞從舊微載體表面有效脫落，并保持再次“爬球生長”的能力，進一步在新微載體上黏附生長是微載體培養工程放大的難點[10]。文獻表明，利用“球到球”的傳代方式，細胞不通過消化脫落，而是直接讓細胞從舊微載體以“細胞橋”的方式向新微載體上轉移[11]，雖然可以有部分細胞能夠完成此種放大過程，但其放大效率不高，放大比率有限，一般是1 ∶1或1 ∶2進行放大[12]，同時也造成較高的“空球率”，培養效果不佳，浪費培養資源[13]。采用胰酶消化的方式，將細胞從微載體上消化下來后，再與新微載體混合重新黏附，可以使得傳代后的細胞均勻黏附于新微載體表面，充分利用生長空間，可獲得較好的培養效果。

循環灌注培養方式是傳統灌注培養方式的一種優化方式[14]。傳統的灌注培養方式是指在新鮮培養液流入的同時，用過的培養液以相同的速度流出。該方式雖然可以獲得不錯的培養效果，但存在諸多弊端，如新鮮培養液的利用率不高，細胞在沒有完全利用完培養液中營養成分時可能已經被抽離出反應器造成浪費；培養液預備量較大的同時，廢液處理量也較大，通常在傳統灌注培養周期內會造成10～20倍培養體積的液體處理量[15]。而循環灌注方式完全克服了傳統灌注方式的缺點，灌注量僅為培養體積的3倍，通過控制灌注液的灌注速率配合細胞的生長速率，供應充足的營養，并有效稀釋代謝副產物的濃度，細胞的培養效果在本研究3種培養工藝中是最好的。

根據本研究中3種培養方式的特點及從5 L反應器至 60 L 反應器規模放大的實際應用結果，可以設計出如下工藝流程：（1）Marc-145細胞的種子培養可以在小規模的生物反應器（15～30 L）中進行高微載體用量的循環灌注培養，充分利用微載體的生長表面，在較短的時間內能夠獲得最多的種子細胞，為放大培養規模提供細胞準備。（2）利用胰酶消化傳代工藝進行種子細胞的傳代放大，通過至少1 ∶3的放大比例將種子接種于60～120 L動物細胞反應器中進行再培養。（3）在傳代放大后，控制Marc-145細胞的接種細胞密度，維持細胞與微載體之間合適的接觸比例，采用分批換液的培養方式，簡化反應罐上操作及所需設備，使得細胞均勻分布在微載體表面，迅速生長，達到接毒要求，進行病毒增殖。上述流程已在該疫苗生產企業得到實際應用，企業生產過程數據未標出。

綜上所述，本研究比較了3種培養方式對Marc-145細胞微載體懸浮培養的實際效能，由此制定并實施可能的應用流程，為我國PRRS疫苗的規模化生產提供了研究基礎。

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